اثر ویسکوزیته نمونه بر جداسازی و رزولیشن ستون های ژل فیلتراسیون

به ترتیب از A به C به وسیله افزودن دکستران , ویسکوزیته زیاد شده است .

مراحل خالص سازی

GF: Gel filtration

HIC: Hydrophobic interaction

RPC: Reversed phase

IEX: Ion exchange

AC: Affinity

اثر حجم نمونه تزریقی بر جداسازی و رزولیشن ستون های ژل فیلتراسیون

 

به ترتیب از آبی به قرمز حجم نمونه تزریقی به ستون ژل فیلتراسیون اضافه می شود .

رزولیشن در ستون های ژل فیلتراسیون

برای بزرگتر دیدن تصویر بر روی آن کلیک کنید

1- نمودار اول - تفکیک رضایت بخش :

بدون نقص ، پیک های متقارن


2- نمودار دوم - تفکیک ناچیز :

فاکتورهای مؤثر در تفکیک ، شامل نوع ژل انتخاب شده ، اندازه ذرات ، حجم نمونه تزریقی ، حجم ستون ، شدت جریان را بررسی نمایید .


3- نمودار سوم - ستون بدون شست و شو :

بعد از عبور بافر به اندازه Vt  ، هنوز پیک دیده می شود . همیشه بین دو تزریق نمونه در ستون ، یک مرحله شست و شو قرار دهید .

ممکن است مولکولها با ژل اتصال غیر ویژه داشته باشند . اگر اثرات متقابل ماهیت یونی داشته باشد ، برای شست وشو غلظت نمک را بالا ببرید (تا 150mM ) . این کار ممکن است به شست و شو کمک کند . اگر اثرات متقابل ماهیت هیدروفوبیک داشته باشد ، غلظت نمک را پایین آورید ، PH را بالا ببرید یا از یک دترجنت یا حلال آلی استفاده نمایید . این کار ممکن است به شست و شو کمک کند .


4- نمودار چهارم - پیک پیشتاز :

پیک نامتقارن : نمونه شسته شده ، به وسیله گزینش کردن یک راه ویژه در ستون ، قبل از حجم تهی دیده می شود . این عمل در اثر زیاد پک شدن به وسیله فشار زیاد یا سرعت زیاد ، رخ می دهد . ممکن است مجبور به پک کردن دوباره ستون شوید .


5- نمودار پنجم - پیک دنباله دار :

پیک نامتقارن : نمونه به صورت ناهموار و ناجور اعمال شده است .

اگر ممکن است بالای ستون را چک کنید . از پک شدن ستون به صورت هموار و یکنواخت و استعمال نمونه بدون آشفتگی در ستون ، مطمئن شوید . پیک های دنباله دار در اثر کم پک شدن به وجود می آید . (پک شدن به وسیله فشار کم یا سرعت کم) .

اثر سرعت فاز متحرک بر جداسازی و رزولیشن ستون های ژل فیلتراسیون

اثر سرعت فاز متحرک بر جداسازی و رزولیشن ستون های ژل فیلتراسیون

افینیتی کروماتوگرافی

افینیتی کروماتوگرافی :افینیتی کروماتوگرافی یکی از روش های جداسازی نمونه های پروتئینی است که خیلی زیاد مورد استفاده قرار می گیرد و بسیار گزینش پذیر و مؤثر است . این تکنیک بر پایه اثرات متقابل منحصر به فرد موجود بین یک مولکول و یک لیگاند متصل به یک ماتریکس است .

کارهای لازم برای طراحی یک افینیتی کروماتوگرافی عبارتند از :1- پیدا کردن یک لیگاند که ویژگیهای کافی داشته باشد .
2- پیدا کردن شرایط مناسبی که در آن لیگاند و پروتئین هدف به هم متصل شوند . همچنین به همان راحتی هم بتوانند از هم جدا شوند .

مراحل کار با کروماتوگرافی افینیتی را می توان به 3 مرحله اصلی تقسیم کرد .

1-Equilibration :

اولین قدم در کروماتوگرافی افینیتی آماده سازی فاز ساکن است . فاز ساکن معمولا ترکیبی است حل نشدنی از یک پلیمر هیدروفوبیک , برای مثال , آگاروز . باید این فاز را با بافرهای لازم به تعادل رساند و شرایط را برای چسبیدن پروتئین هدف آماده کرد .

2-Application of Sample :

در یک نمونه که حاوی انواع مختلف پروتئین می باشد , پروتئین هدف جلب فاز ساکن می شود , به آن متصل می شود و سایر پروتئین ها به راحتی از میان فاز ساکن عبور می کنند و شسته می شوند . موفقیت این بخش , به مقدار توانایی مولکول هدف برای متصل شدن به لیگاند بستگی دارد . ثابت تفکیک (KD) وابسته است به مقدار نیروی موجود بین مولکول هدف و لیگاند . (KD) کمتر یعنی پیوند قویتر . مقدار (KD) بین 10 به توان 4- و 10 به توان 6- ایده آل برای متصل شدن پروتئین هدف و فاز ساکن می باشد . اگر (KD) بسیار بزرگ باشد , پروتئین هدف به ستون نمی چسبد . اگر (KD) خیلی کوچک باشد , پروتئین هدف به سختی به لیگاند ها متصل می شود و به صورت برگشت ناپذیر جذب آن می شود . در طی شستشو , به استثنای پروتئین هایی که محکم به فاز ساکن چسبیده اند , اغلب مولکولهایی که دارای اثرات متقابل ضعیف هستند , توسط مثلا , یک محلول حاوی غلظت بالای نمک , شسته می شوند .

3-Elution :

به دنبال شست و شو در مرحله آزاد سازی پروتئین ها به صورت یک باند از فاز ساکن جدا می شوند . پس از اینکه نمونه هدف به فاز ساکن چسبید , گرادیانت بافر لازم است . در کروماتوگرافی افینیتی باید شرایط چسبیدن و شرایط رها شدن به راحتی فراهم شود .

2 راه برای شست و شوی مولکول هدف از فاز ساکن وجود دارد .

1- تغییرمقدار (KD) از کم به زیاد . مقدار (KD) ایده آل برای شست و شو معمولا بین 10 به توان 1- و 10 به توان 2- می باشد . همچنین مقدار (KD) می تواند با تغییر شرایط عوض شود . شرایطی مثل غلظت نمک , PH و دما .

2- اضافه کردن ماده ای که به عنوان رقیب به لیگاند متصل شود و باعث آزادی پروتئین هدف شود . یا ماده ای که به عنوان رقیب به پروتئین هدف متصل شود و همراه آن , به وسیله بافر از ستون و فاز ساکن شسته شود .

شکل شماره 2 : آزادسازی پروتئین های هدف به وسیله پروتئین های رقیب

شکل شماره 3 : آزادسازی پروتئین های هدف به وسیله لیگاندهای رقیب

مولکولهای هدف :
3 گروه از مولکولهای هدف وجود دارند که می توان در آن از روش افینیتی کروماتوگرافی استفاده کرد .

1- اتصالات ویژه مستقر بر روی مولکولهای زیستی فعال : این مولکولها شامل رسپتور , آنتی بادی وآنزیم های فعال می باشند . این مولکولها توسط لیگاندهای طبیعی خود یا لیگاند های شبیه به آن مورد استفاده قرار می گیرند .

2- گروههای مصنوعی که روی مولکولهای طبیعی قرار گرفته اند : برای مثال پلی ساکارید ها . این کار برای جداسازی گروهی آن سودمند است .

3- مولکولهای مهندسی شده که شامل یک برچسب افینیتی است : برای مثالی از این نوع برچسبها GST مخفف Glutathione-S-Transferase یا پروتئین هایی با هیستیدین قابل دسترسی . این برچسب ها اکثرا مهندسی شده تا پروتئین ها جداسازی شوند .

لیگاندهایی که فقط مخصوص یک مولکول خاص باشند را کمتر می توان به صورت یک ماتریکس تجاری پیدا کرد . لیگاندهایی که برای یک گروه خاص استفاده می شوند معمولا به صورت تجاری قابل دسترس هستند , زیرا بیشتر مورد استفاده قرار می گیرند . لیگاندهای کوچک تر ممکن است در بدست آمدن نتایج مشکلاتی را به وجود آورند . یکی از آنها تداخل شکل فضایی است .دیگر مشکل عدم دستیابی به لیگاند است .

شکل شماره 4 : وقتی لیگاند یک فاز ساکن تهیه می شود , اغلب لازم است که دارای یک بازوی بلند باشد , تا مانع از تداخل و اتصال مولکول و لیگاند نشود .

جدول خصوصیات و کاربردهای ژلهای کروماتوگرافی (ادامه پست قبلی )

Superdex :
ترکیبی از پیوندهای عرضی بین آگاروز و دکستران . با رزولیشن بالا و زمان کوتاه در جداسازی و برگشت پذیری مناسب .

Superose :
پیوندهای عرضی بسیار زیاد بین مولکولهای آگاروز

Toyopearl HW :

Toyopearl ژل کروی نیمه سخت است و برای فشارهای متوسط و پایین در کروماتوگرافی مایع به کار می رود . ژل Toyopearl HW ترکیبی از پلیمر وینیل آبدوست می باشد , که شامل تعداد گروههای hydroxyl می باشد و از اتمهای C, H , Oساخته شده است . Toyopearl از نظر مکانیکی سخت است و برای جریانهای بالا استفاده می شود .

Ultrogel :دانه های آگاروز

جدول خصوصیات و کاربردهای ژلهای کروماتوگرافی

Sephacryl :از پیوندهای عرضی بین آلیل دکستران و N,N’-methylenebisacrylamide تهیه می شوند .گرید HR دارای اندازه ذرات کوچکتری است . توزیع اپتیمم شده و جداسازی بهتر و جریان سریعترمی باشد .



Sephadex :دانه های ژل از پیوندهای عرضی دکستران و epichlorohydrin تهیه می شوند . در بسیاری از موارد در پروسه های صنعتی استفاده می شوند . همچنین در نمک زدایی و تعویض بافر سودمند است .

Sepharose :
دانه های آگاروز برای فرکشنه کردن مولکولهایی که دارای جرم مولکولی بالایی هستند استفاده می شوند . از پیوندهای عرضی بین ذرات آگاروز تشکیل شده است و دارای مقاومت بیشتری هستند . و بنابراین تطبیق پذیری زیادی در انتخاب بافرها و شوینده ها دارد . تقریب درصد غلظت آگاروز در اولین عدد شماره آن نمایش داده می شود .اغلب برای جفت کردن لیگاندهای افینیتی , یا جداسازی مولکولهای خیلی درشت و ذرات ویروس ها استفاده می شوند .

جدول محدوده جداسازی برای انواع ژلهای کروماتوگرافی

ژل کروماتوگرافی , پروتئین ها , پپتیدها , و الیگونوکلئوتیدها را بر اساس اندازه جداسازی می نماید . مولکولها از میان بستری از خلل و فرج ذرات ژل حرکت و به اندازه های کوچکتر یا بزرگتر رتبه بندی می شوند . مولکولهای کوچکتر با هم در خلل و فرج ذرات ژل نفوذ کرده , از اینرو حرکت آنها کند تر است . در صورتیکه درشت مولکولها کمتر وارد آن شده سرعت آنها بیشتر است . هر دو عامل جرم مولکولی و شکل فضایی در مقدار نگهداری شرکت دارند . ژل فیلتراسیون در آنالیز اندازه مولکولی , جداسازی یک مخلوط نمونه و یا در نمک زدایی یا تعویض بافر در تهیه ماکرومولکولها , استفاده می شود .

محدوده جرم مولکولی برای ژلها :

SOP آماده سازی و ساخت یک ستون کروماتوگرافی دست ساز

هدف :
آماده سازی و ساخت یک ستون کروماتوگرافی برای جداسازی پروتئین ها , که ژل مناسب بعدا در آن pack خواهد شد .

کاربرد :

کاربرد در کلیه روش های کروماتوگرافی .

مواد و تجهیزات :۱- لوله ای شیشه ای که انتهای آن به صورت قیف است ( خروجی ) و ورودی آن کمی گشاد شده است . ( باید طول شیشه و قطر شیشه متناسب با حجم ژل باشد )
۲- 5 cm شیلنگ متناسب با خروجی ستون .
۳- گیره برای بستن خروجی .
۴- پایه ستون .
۵- گیره برای نصب ستون روی پایه .
۶- پشم شیشه .
۷- لوله شیشه ای نازک به قطر تقریبی cm0.5 الی cm0.7 (طوری که به راحتی داخل ستون شود ) و طولی بلند تر از طول ستون . ۸- درپوش لاستیکی سوراخ دار برای ورودی ستون .
۹- 2 عدد سرسمپلر کوچک (زرد رنگ 100 لاندا)
۱۰- شیلنگ به طول یک متر.
۱۱- یک لوله نازک به طول 10 cm و قطر متناسب با شیلنگ یک متری .

ملاحظات ایمنی :
برای جلوگیری از خطرات بیولوژیک , الرژیک و شیمیایی , پوشیدن روپوش و کفش و دستکش ضروری می باشد .

روش کار :
۱- ستون را به وسیله آب مقطر و سپس استون شستشو دهید .
۲- مقداری پشم شیشه را توسط آب مقطر خیس کرده وارد ستون می کنید .
۳- توسط لوله نازک پشم شیشه را به انتهای ستون رانده ,در حین اینکه پشم شیشه را به انتهای ستون می کو بانید , همزمان ستون را بچرخانید . تا پشم شیشه یک نواخت در انتهای ستون فشرده شود
۴- حال مقداری آب مقطر درون ستون بریزید , تا ذرات خرد شده پشم شیشه را با آن خارج کنید .
۵- مراحل 3 الی 4 را 3 مرتبه تکرارکنید . تا پشم شیشه کاملا فشرده شده و سطح آن یکنواخت شود .
۶- ستون را توسط گیره به پایه ستون متصل نمایید .
۷- حال شیلنگ 5cm را به خروجی ستون وصل کنید .
۸- یکی از سرسمپلر ها را به شیلنگ 5cm وصل کنید . طوری که از نوک آن بعدا بتوان برای وصل کردن به شیلنگ پمپ پریستالتیک استفاده کرد .
۹- شیلنگ خروجی ستون را توسط گیره ببندید . و کمی اب درون ستون بریزید تا پشم شیشه خشک نشود .
۱۰- سرسمپلر دیگر را وارد سوراخ درپوش لاستیکی کرده و نوک آن را درون شیلنگ یک متری محکم نمایید . و درب لاستیکی را داخل ورودی ستون کنید .
۱۱- سر دیگر شیلنگ یک متری را به لوله 10 cm وصل می نماییم .( این لوله ورودی در ظرف بافر قرار خواهد گرفت ) .

گزارش :گزارش تهیه ستون را در دفتر کارهای روزمره آزمایشگاه ثبت می کنیم .