محلول سازی نمونه برای IEF

انتخاب راهکار برای محلول سازی پروتئین های موجود در نمونه ، به ماهیت نمونه بستگی دارد . در صورتیکه نمونه از بافتهای سلولی یا بافتی استخراج شده باشد ، اولین گام لیز کردن سلولها و خارج کردن محتوای پروتئینی آنهاست . روشهای شیمیایی و فیزیکی مختلفی برای لیز کردن و متلاشی کردن دیواره سلولها وجود دارد . روشهای ملایمی مانند شکستن دیواره سلولها توسط آنزیم هایی مانند لایزوزایم Lysozyme و یا روشهای خشنی مثل استفاده از پرس فرانسوی .
نمونه تهیه شده برای الکتروفورز 2 بعدی باید عاری از پیوندهای غیر کووالان باشد . یعنی پروتئین های نمونه به پلی پپتیدهای منفرد و محلول تبدیل شده باشند . و همینطور باید نمکها ، لیپیدها ، پلی ساکاریدها و اسیدهای نوکلوئیک را که در الکتروفورز 2 بعدی مزاحمت ایجاد می کنند حذف کرد . همچنین حلالیت نمونه در حین انجام الکتروفورز 2 بعدی نباید از بین رود .

ادامه دارد....

راهنمایی های کلی در آماده سازی نمونه برای الکتروفورز 2 بعدی

روش آماده سازی نمونه علاوه بر کارآمد بودن ، باید تکرار پذیری نیز داشته باشد . این نکته بسیار مهم است . در نمونه سازی ممکن است از مواد زیادی مانند دترجنت ها ، عوامل کائوتروپیک و عوامل احیا کننده استفاده شود . در هر حال بهینه کردن روش آماده سازی نمونه به صورت تجربی صورت می پذیرد . اما موارد زیر را می توان در نظر داشت .

1- به حداقل رساندن مراحل آماده سازی نمونه :
افزایش مراحل آماده سازی نمونه اگر چه در مواردی موجب بهبود کیفیت نمونه می گردد ، اما اکثرا موجب هدر رفتن وقت و مواد و نیز از دست رفتن پروتئین ها می گردد .

2- ممانعت از توده ای شدن پروتئین ها
پروتئین ها به هیچ وجه در نمونه و یا در مراحل بعد از الکتروفورز ، نباید رسوب و یا حلالیت آنها از بین برود .

3- خارج کردن اسیدهای نوکلوئیک و دیگر مولکولهای تداخل کننده
مانند نمک ها و چربی ها و قند ها

4- حذف موادی که می توانند تولید ذره نمایند
این مواد ( لیپیدها و مواد جامد ) باید از محیط نمونه خارج گردند .

5- محلول سازی تمام انواع پروتئین ها ( چه آبگریز و چه آبدوست )
باید تمام انواع پروتئین ها در محلول به صورت آزاد باشند ، یعنی تمام پیوند های غیر کووالان در کمپلکس ها و توده های پروتئینی از بین برود .

6- به حداقل رساندن تغییرات پروتئینی در نمونه
مانند اثر آنزیم ها و اثر گرما

7- حذف پروتئین هایی که فراوانی زیادی در نمونه دارند
این پروتئین ها ، دیگر پروتئین های نمونه را تحت پوشش می دهند.

روشهای آماده سازی نمونه برای IEF (مقدمه)

قدم اول در آماده سازی نمونه استخراج پروتئین  ها از منبع مورد نظر است . ممکن است استخراج پروتئین ها مستقیما توسط بافر محلول سازی Solubilization Buffer صورت پذیرد . ممکن است این عمل توسط روش های متلاشی ساختن سلولها Cell disruption و بافتها انجام شود و سپس پروتئین های استخراج شده در بافر محلول سازی کاملا حل شوند . برای استخراج کامل پروتئین های داخل سلولی ، سلول باید کاملا متلاشی شود . انتخاب روش متلاشی سازی  بستگی به این دارد که نمونه از چه منبع بیولوژیکی ، سلول ، بافت جامد و یا از منابع دیگری ، به دست آمده باشد . بعد از استخراج ، این نمونه ها باید برای انجام الکتروفورز دو بعدی آماده شوند . منظور از آماده سازی نمونه ، محلول ساختن حداکثر پروتئین های موجود و حفظ حلالیت آنها در حین روند الکتروفورز دو بعدی است .
هیچ روش منفردی را نمی توان بصورت عمومی برای آماده سازی نمونه هایی که توسط الکتروفورز دو بعدی مورد بررسی قرار می گیرند ، معرفی کرد . در واقع ماهیت متفاوت نمونه ها امکان به کار گیری روشی یکسان را در آماده ساختن آنها برای الکتروفورز دو بعدی منتفی می سازد . از طرفی دیگر ، روش بکار گرفته شده در هر تجربه ای به هدف طراحی شده نیز بستگی دارد . برای مثال ، ممکن است هدف  از انجام الکتروفورز دو بعدی دستیابی به پروتئین هایی با ویژگی های خاص باشد ، یا ممکن است دستیابی به نقشه کامل پروتئینهای نمونه ، از اهمیت بیشتری برخوردار باشد . در هر یک از این موارد استراتژی های انتخابی کاملا با هم تفاوت دارند . در بهینه سازی استراتژی آماده سازی نمونه  باید از نتایج مورد نظر ، انتظاری مشخص داشت . باید برای ما مشخص باشد که نشان دادن نمونه به طور کامل مهمتر است ، یا به دست آوردن یک الگوی تکرار پذیر .
اضافه کردن مراحل آماده سازی نمونه می تواند کیفیت نتیجه نهایی را بهتر کند ، اما این امر به قیمت از دست دادن گروهی از پروتئین ها تمام می شود . به هر حال ، این تناقض و نسبت معکوس بین کیفیت نمونه بهبود یافته و نمونه سازی کامل پروتئین ها باید کاملا در نظر گرفته شود .
در هر صورت ، خطوط راهنمای کلی ، برای آماده سازی نمونه وجود دارد که با پیگیری آنها می توان قدمهای نخست را در این راه به درستی برداشت و سپس با تجربه بهترین نمونه را بدست آورد .