روش رنگ آمیزی ژل به روش نیترات نقره (آمونیاکی)

این روش از سایر رنگ آمیزی ها بسیار حساس تر است . باندی که در روش کوماسی بلو ممکن است دیده نشود ، در این روش به سادگی دیده می شود .


محلول های مورد نیاز برای رنگ آمیزی :
(1): محلول ثبوت یک: 100ml محلول TCA (تری کلرواستیک اسید 20 %)
(2): محلول ثبوت دو : 40ml اتانول و 10ml اسید استیک را توسط آب مقطر به حجم 100ml برسانید.
(3): محلول گلوتار آلدهید 10%: 20ml از محلول استوک 50% گلوتار آلدهید را با آب مقطر به حجم 100ml برسانید.(به علت گرانی این ماده می توان از محلول رقیق تر استفاده کرد ولی زمان بیشتری را در نظر گرفت )
(4): محلول رنگ آمیزی (محلول نقره آمونیاکی): 21ml محلول هیدروکسید سدیم 0.36% و  1.95mlمحلول آمونیاک 25% را در یک ارلن بریزید. سپس در یک لوله آزمایش ، 0.8g نیترات نقره و 4ml آب مقطر ریخته ، حل می کنیم . محلول نیترات نقره را ، قطره قطره به محتویات ارلن اضافه کنید.
در صورت دیدن رسوب قهوه ای ، به آن دو قطره آمونیاک اضافه کنید و ظرف را تکان دهید تا محلول شفاف شود . حجم نهایی را به 100ml برسانید.
(5): محلول ظهور : 10mg اسید سیتریک و 0.1ml فرمالدهید (35%) را به حجم 200ml برسانید .
(6): محلول متوقف کننده : محلول متوقف کننده همان محلول ثبوت دو (2) می باشد .


مراحل رنگ آمیزی :
1- ابتدا ژل را توسط آب مقطر و درون ظرفی که روی شیکر قرار دارد به مدت 5 دقیقه بشویید.
2- اب مقطر را از ظرف خارج نمایید .
3- محلول ثبوت (1) را روی ژل ریخته ، جوری که روی آن را بپوشاند. به مدت 20 الی 30 دقیقه آن را شیک نمایید.
4- محلول ثبوت (1) را خارج کرده ، محلول ثبوت (2) را به ظرف اضافه نمایید . 20 دقیقه آن را شیک نمایید.
5- ژل را 2 بار و هر بار به مدت 5 الی 10 دقیقه با آب مقطر فراوان شیک نموده ، تا خوب شسته شود .
6- 100ml محلول گلوتارآلدهید را به ظرف اضافه کرده ، به مدت 20 الی 30 دقیقه آن را شیک نمایید.
7- پس از خارج کردن محلول ، ژل را 4 بار ، هر بار به مدت 5 دقیقه ، توسط آب مقطر شیک نمایید وبشویید.
8- محلول رنگ آمیزی را به ظرف اضافه کرده ، آن را به مدت 30 دقیقه شیک نمایید.
9- پس از خارج کردن محلول ، ژل را 3 بار ، هر بار به مدت 5 دقیقه ، توسط آب مقطر شیک نمایید وبشویید.
10- 100ml محلول ظهور را به ظرف اضافه کرده ، ظرف را تا ظهور باندها ، بسیار آرام تکان دهید.
11- پس از ظهور باندها به صورت مطلوب ، قبل از تیره شدن زمینه ژل ، محلول ظهور را به سرعت خارج کرده ، محلول متوقف کننده را اضافه نمایید.

نمونه ای از ژل رنگ شده با این روش

روش رنگ آميزی ايميدازول – روی

اين روش رنگ آميزی به حساسيت روش نقره است و تنها یک ساعت طول می کشد. این روش رنگ آميزی نگاتيو است که در آن زمينه ژل به جاي پروتئين ها رنگ می شود. رنگ به صورت کمپلکسي از "SDS" و ايميدازول روی و به رنگ سفید کدر در ژل رسوب ميکند . مناطقی از ژل که حاوی پروتئين هستند شفاف باقی می مانند . برهم کنشی بين رنگ و پروتئين وجود ندارد ودر صورت نياز، ژل را کاملاٌ می توان رنگ زدايی کرد . اين روشها را برای ژلهای 2-D آناليتيکال و ژلهای SDS-PAGE هم می توان بکار برد . برای ژلهای نازک تر ( کمتر از يک ميلی متر ) زمان انکوباسيون در روش ايميدازول- روی را می توان کاهش داد . تکه ژلهايی که توسط ايميدازول- روی رنگ آميزی شده اند را می توان توسط اسيد سيتريک 2% رنگ زدايی کرد .

محلول های مورد نیاز :

محلول تثبیت کننده
50%(v/v) متانول , 5%(v/v) اسید استیک گلاسیال , 45%(v/v) آب مقطر

محلول 0.2M سولفات روی (محلول شماره 2)
28.7g سولفات روی در 500ml آب مقطر

محلول 0.2M ایمیدازول , 0.1% SDS (محلول شماره 3)
6.8g ایمیدازول , 500ml , 0.5g SDS آب مقطر

نحوه رنگ آمیزی :
1- بعد از اتمام الکتروفورز , ژل را به مدت 20min در محلول تثبیت کننده غوطه ور نمایید .
2- محلول را دور ریخته و ژل را 2 بار به مدت 15min در آب مقطر , توسط شیکر به آرامی شیک نمایید
3- در محلول شماره 3 به مدت 15min و در انکوباتور , توسط شیکر به آرامی شیک نمایید
4- محلول شماره 3 را دور ریخته و محلول شماره 2 را به آن اضافه نمایید . 30 الی 60 ثانیه شیک نمایید.
5- وقتی رنگ رضایت بخشی ظاهر شد , می توانید محلول را دور ریخته و به جای آن آب مقطر به ژل اضافه کنید .

در این روش رنگ آمیزی , ژلها اندکی شکننده تر به نظر مي رسند و درصورت نگهداری طولانی مدت مستعد خشک شدن هستند. ضمناً برای مشاهده نياز به زمينة تيره دارند. همچنین می توانید این روش را همراه با روش کوماسی بلو انجام دهید . به نحوی که پس از رنگ آمیزی کوماسی بلو , مراحل 2 تا 5 را انجام دهید .

روش رنگ آميزی کوماسی بلو کلوئيدی

اين روش درکمتر از 2 ساعت پروتئين ها را در يک زمينه تميز و با حساسيتی درحدود روش نقره رنگ آميزی می کند. افزودن اتانول و سولفات آمونيوم به محلولی از آبی کوماسی G-250 در اسيد فسفريک رقيق، رنگ مذکور را به سمت شکل کلوئيدی آن سوق می دهد. در طی رنگ آميزی ، تعادلی بين اشکال کلوئيدی وفرم پراکنده مولکولی رنگ وجود دارد . فرم پراکنده رنگ وارد ماتريکس ژل شده و پروتئين ها را رنگ می کند. در حالی که فرم کلوئيدی بيرون نگه داشته می شود و به اين ترتيب از رنگ آميزی زمينه پرهيز می شود.

محلول مورد نیاز :

تهیه 1000ml محلول رنگ آمیزی
100ml از محلول آمونیوم سولفات 10% , 20ml از محلول کوماسی بلو 0.1% , 30ml از محلول اورتو فسفریک اسید 3% , 200ml از محلول اتانول 20% , 650ml آب مقطر

نحوه رنگ آمیزی :
1- پس از الکتروفورز، ژل را 2 بار به مدت 3min در آب مقطر , توسط شیکر به آرامی شیک نمایید.
2- ژل را در محلول رنگ آمیزی کوماسی بلو کلوئيدی به مدت 2 ساعت قرار دهید .
3- باندها باید بدون رنگ زدایی دیده شوند , اما می توانید با آب مقطر نیز رنگ زدایی کنید .

محلول رنگ را پيش از استفاده نبايد صاف کرد.