SOP تعین حجم تهی و حجم نهایی در کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون

هدف :
۱- تعین حجمی که پس از آن اولین پروتئین از ستون خارج می شود و همچنین حجمی که آخرین پروتئین از ستون خارج میشود
۲- امتحان کردن درستی packing ستون

کاربرد :
در کروماتوگرافی به روش ژل فیلتراسیون(غربالی) این روش کاربرد دارد .

مواد و تجهیزات :
۱- ستون ژل فیلتراسیون(غربالی)
۲- برومو فنول بلو 0.005 گرم
۳- دکستران بلو 0.05 گرم
۴- سرنگ cc 5
۵- فیلتر
۶- شیشه cc 5
۷- آب مقطر
۸- پیپت cc 2 یک عدد
۹- پیپتور
۱۰- بشر یا ارلن برای خروجی ستون
۱۱- پیپت cc 10 یک عدد
۱۲- ظرف و بافر جهت شستشوی ستون(با توجه به نمونه ای که بعدا کار می شود این بافر می تواند فرق کند )
۱۳- استوانه مدرج cc 250 ( با توجه به حجم ستون )

ملاحظات ایمنی :
برای جلوگیری از خطرات بیولوژیک , الرژیک و شیمیایی , پوشیدن روپوش و کفش و دستکش ضروری می باشد .

روش کار :
۱- 5 cc محلول رنگ حاوی ( دکستران بلو 1 درصد و برومو فنل بلو 0.1 درصد ) درست می کنیم .
۲- فیلتر را به سرنگ متصل می کنیم .
۳- محلول رنگ را فیلتر می کنیم .
۴- بافر روی سطح ژل داخل ستون را خالی می کنیم .
۵- یک الی دو cc از محلول رنگ را توسط پیپت cc 2 بر می داریم .
۶- به آرامی پیپت را درون ستون وارد می کنیم . طوری که نوک پیپت به نزدیک سطح ژل برسد .
۷- نوک پیپت را به جداره شیشه ستون می چسبانیم .
۸- به آرامی طوری که سطح ژل به هم نخورد , رنگ را خالی میکنیم و همزمان پیپت را دور تا دور شیشه ستون می چرخانیم ( نمونه گذاری ) .
۹- در زیر ستون یک ظرف ( ارلن یا بشر) قرار می دهیم .
۱۰- شیر خروجی ستون را باز می کنیم .
۱۱- زمانی که سطح رنگ به سطح ژل رسید , دوباره شیر خروجی را می بندیم .
۱۲- حال با یک پیپت تمیز حدود 1 الی 2 cc از بافر مورد نظر (بافرشستشو) را درست به همان طریق که رنگ را نمونه گذاری کرده اید , به ستون اضافه می کنید . ( هدف از این کار شستشوی شیشه داخلی ستون که آغشته به رنگ است , می باشد ).
۱۳- دوباره شیر خروجی ستون را باز می کنیم .
۱۴- زمانی که سطح بافر به سطح ژل رسید , دوباره شیر خروجی را می بندیم .
۱۵- مرحله 12 را دوباره تکرار می کنیم . اگر بافر روی سطح ژل الوده به رنگ نبود ,تا حدود 10 الی 15 سانتیمتر بالا تر از سطح ژل بافر اضافه می کنیم .
۱۶- ورودی ستون را به منبع بافر متصل می کنیم .
۱۷- شیر خروجی ستون را باز می کنیم . و می گذاریم که ستون کار کند .
۱۸- اولین قطره ای که از رنگ دکستران بلو( ابی رنگ ) خارج شد , شیر خروجی را می بندیم و حجم محلول داخل ظرف زیر ستون را توسط استوانه مدرج به دست می آوریم و یادداشت می نماییم .این حجم معرف حجم تهی ستون می باشد .
۱۹- ظرف خالی را زیر ستون گذاشته و شیر خروجی ستون را باز می کنیم و می گذاریم که ستون کار کند .
۲۰- آخرین قطره ای که از رنگ برومو فنل بلو( بنفش رنگ ) خارج شد , شیر خروجی را می بندیم و حجم محلول داخل ظرف زیر ستون را توسط استوانه مدرج به دست می آوریم و یادداشت مینماییم. این حجم بعلاوه حجم تهی , معرف حجم نهایی ستون می باشد .
۲۱- شیر خروجی ستون را باز می کنیم تا ستون کاملا شسته شود . هنگامی که ستون کاملا شسته شد , متوانیم شیر خروجی را ببندیم . ۲۲- با داشتن حجم تهی و حجم نهایی می توانیم که اولین نمونه پروتئین را بعدا نمونه گذاری کنیم .
۲۳- یک برچسب که مشخصات ستون روی آن ثبت شده است , روی ستون می چسبانیم . مشخصاتی همچمون نوع ژل , ارتفاع ستون , نام شخص , تاریخ پر کردن , حجم تهی , حجم نهایی

نکته :
اگر در طی کار کردن ستون متوجه شدیم که رنگ از یک مسیر بیشتر جریان دارد ( شیار ادٌی) , یعنی اینکه ستون خوب pack نشده است و باید ستون دوباره pack شود .

گزارش :
۱- مشخصات ستون را به صورت برچسب روی ستون نصب می کنیم .
۲- گزارش تهیه ستون و حجمهای تهی و نهایی را در دفتر کارهای روزمره آزمایشگاه ثبت می کنیم .