اساس کروماتوگرافی و انواع آن

اساس کروماتوگرافی :
اساس کروماتوگرافی بر اصول کلی پخش فاز بنیان نهاده شده است. به طور خلاصه، در این روش جریان یک فاز از داخل فاز ساکنی میگذرد و در این حال فاز ساکن اجزای آنرا به طور انتخابی خارج میکند. این خروج یک عمل تعادلی است و مولکولهای اجزاء دوباره داخل فاز متحرک میشوند. هنگامی که ثابت پخش دو یا چند جزء در این دو فاز با هم متفاوت باشند، اجزای موجود در فاز متحرک از هم تفکیک میشوند. به طور ساده میتوان گفت که هر چه فاز ساکن یک جزء را محکمتر نگه دارد، در صد مولکولهای جزئی که بی حرکت نگه داشته شده بیشتر میشود. جزء دیگری که با شدت کمتر نگه داشته میشود نسبت به جزء اول در فاز متحرک درصد مولکولی بیشتری خواهد داشت. بنابراین به طور متوسط مولکولهای جزئی که با شدت کمتر نگه داشته میشوند، نسبت به مولکولهای دیگر با سرعت بیشتری در حرکتند . در نتیجه جداسازی انجام می شود .
فاصله باندها به طور خطی به مسافتی که در ستون طی میشود بستگی دارد. به طور کلی هر چه مسافت طی شده بیشتر باشد، فاصله باندها زیادتر خواهد شد. یادآور میشود که اجزای مخلوط باید ضرایب پخش متفاوتی داشته باشند تا بتوان آنها را به کمک پخش فاز تفکیک کرد. در صورتی که این ضرایب به هم نزدیک باشند، اجزای مربوط فقط به طور جزئی به باندهای جداگانه تفکیک میشوند. البته میتوان طول مسیر را زیاد کرد و به اجزاء فرصت داد تا بیشتر از هم جدا شوند .

انواع آن :
کروماتوگرافی چهار نوع مهم دارد که بر اصول توصیف شده بالا متکی هستند . این انواع عبارتند از کروماتوگرافی گازی (کروماتوگرافی تفکیکی گاز مایع) ، کروماتوگرافی ستونی ، کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) و کروماتوگرافی کاغذی .
ما در اینجا 4 نوع مهم از کروماتوگرافی ستونی , که از آنها برای جداسازی پروتئینها نیز استفاده می شوند نام برده و توضیح می دهیم .

1- کروماتوگرافي ژلی (Gel Filtration Chromatography)
2- کروماتوگرافي تبادل يوني (Ion Exchange Chromatography)
3- کروماتوگرافي افینیتی (Affinity Chromatography)
4- کروماتوگرافي جذب سطحی (Hydrophobic Chromatography)

کروماتوگرافي ژلي :
اين نوع کروماتوگرافي براي اولين بار در سال 1954 معرفي و در سال 1959 اصلاح شد . در اين روش , جداسازي‌هایي مبتني بر الک کردن مولکولي بر روي اجسام بي‌بار در جريان مهاجرت الکترو اسمزي از داخل ژل‌ها انجام مي‌شود . بدين ترتيب که جداسازي بر مبناي اندازه‌هاي نسبي مولکول ها انجام شده و از اصطلاح صاف کردن به وسيله ژل استفاده مي‌شود . ژل استفاده شده در اين روش بايد بي اثر و پايدار باشد . فاز ساکن از يک قالب متخلخل تشکيل شده که منفذهاي آن به وسيله حلالي که فاز متحرک را تشکيل داده پر شده است . از آنجا که اساس جداسازي بر اين است که مولکول‌هاي بزرگ تر از حد وارد سوراخ‌ها نشده و به ترتيب جرم مولکولي از ستون خارج شوند و مولکول‌هاي کوچک تر بر حسب شدت نفوذشان سوراخ ها را پر کنند پس اندازه سوراخ بسيار مهم است . همچنين گرانروي نمونه نيز اهميت زيادي دارد و نبايد از دو برابر گرانروي شوينده بيشتر باشد . از ديگر عوامل مهم حجم نمونه است بدين ترتيب که هر چه حجم نمونه کمتر باشد ، غلظت هر جزء در محلول خارج شده نيز کمتر خواهد بود . همچنین باندها شارپ تر خواهند شد . مثالی از این ژلها مانند خانواده Sephadex , خانواده Sephacryl
ژل فیلتراسیون یک روش ساده و قابل اطمینان , جهت جدا سازی مولکولها بر اساس سایز آنها می باشد , که برای جداسازی و تخلیص انواع مواد بیولوژیکی که به سهولت با روشهای دیگر امکان پذیر نیست , کاربرد دارد . جدا سازی در ژل فیلتراسیون به دو صورت رخ می دهد . جداسازی (separation) و جزء به جزء (fractionation) شدن . در گروه separation مولکولها به وسیله اختلاف زیاد در مولکولار سایزشان جدا می شوند . یک ماتریکس طوری مولکولها را انتخاب می کند که , مولکولهای درشت تر از میان حجم تهی ستون به اسانی و بدون درگیری شسته شود . در حقیقت مولکولهای کوچک تر در حجم کلی ستون نگه داشته می شوند . در گروه fractionation ماکرو مولکولها بر اساس اختلاف اندازه جدا می شوند . در این کارکرد , تمام اجزاء با اندازه های مولکولی متفاوت مطابق با دامنه جداسازی ژل , درگیر خواهند شد . کاربرد fractionation در ژل فیلتراسیون , تخلیص و تعیین جرم مولکولی پروتئین ها و پپتیدها و اسیدهای نوکلوئیک می باشد .
در حال حاضر ژل هایی مطرح شده اند که resolution بی مانند , در سرعت های بالا و مقاومتی بالا در مقابل فشار و PH دارند .

در زیر جداسازی یک نمونه محتوی پروتئین A با جرم مولکولی 290,000 , پروتئین B با جرم مولکولی 140,000 , serum albumin با جرم مولکولی 67,000 , ovalbumin با جرم مولکولی 43,000 , cytochrome c با جرم مولکولی 12,400 در یک ستون کروماتوگرافی که با fractionation range 15,000 - 150,000 Bio-Gel P-150 . پر شده است , ملاحظه می شود . وقتی که مخلوط پروتئین بر روی ستون گذاشته می شود . پروتئین A اول از همه شسته خواهد شد , زیرا جرم مولکولی آن از محدوده بالایی جداسازی ژل بیشتر است . بنابراین کلا درون خلل و فرج فاز ساکن نمی شود و در فضای خالی بین ذرات ژل (حجم تهی)(V0) ادامه مسیر می دهد . جرم مولکولی cytochrome c از محدوده پایینی جداسازی ژل کمتر است و به طور کامل با ژل درگیر می شود و آخر از همه شسته می شود . پروتئین های دیگر که اندکی درگیر می شوند , به ترتیب نزولی جرم مولکولی شسته خواهند شد .

Vr=V0+KVi

Vr حجم نگهداری پروتئین می باشد . V0 حجمی از فاز متحرک است که بین ذرات فاز ساکن اشغال کرده است (حجم تهی). Vi حجمی از فاز متحرک که درون خلل و فرج ذرات ژل اشغال کرده است (حجم درگیری). K ضریب تفکیک پروتئین است . (مقداری که هر پروتئین می تواند در خلل و فرج فاز ساکن نفوذ کند , که مقدار آن بین 1 و 0 است) . K در مخلوط پروتئینی بالا , برای پروتئین A برابر 0 می باشد .K=1 برای cytochrome c و برای سایر پروتئینهایی که در محدوده جداسازی این ژل است , K بین 0 و 1 می باشد .
ژل فیلتراسیون در جداسازی پروتئین ها بر اساس جرم مولکولی و همچنین برای تعویض بافر استفاده می شود . یک پروتئین حل شده در بافر سدیم استات دارای PH=4 می تواند در یک ستون ژل فیلتراسیون به تعادل رسیده با بافر Tris و PH=8 به کار برده شود . بافر Tris با PH=8 فاز متحرک است . پروتئین در داخل فاز متحرک , در جریان است و مولکولهای بسیار کوچکتر سدیم استات , کاملا درگیر با خلل و فرج ذرات ژل می باشند و نسبت به پروتئین با سرعت کمتری حرکت می کنند .

کروماتوگرافي تبادل يوني :
در اين روش بين فاز متحرک (محلول) و فاز ساکن (جامد) به صورت برگشت پذير يون مبادله مي‌شود . جامد تشکيل‌دهنده فاز ساکن رزين ناميده مي‌شود و پايداري مکانيکي و شيميايي و يکنواختي اندازه ذرات از خصوصيات آن‌ها است. قالب اين رزين‌ها بر پايه يک بسپار بزرگ (معمولا پلي استيرن) استوار است اما برخي از آن ها متکي بر اسيد متا اکريليک هستند ، رزين‌ها به دو نوع تعويض کننده آنيوني و کاتيوني تقسيم مي شوند . هر کدام از اين تعويض کننده‌ها به نوع بازي ضعيف و قوي و اسيدي ضعيف و قوي تقسيم مي‌شوند . مي‌توان اين روش را مانند کروماتوگرافي جذبي در نظر گرفت به گونه اي که رزين‌ها جايگزين جاذب شده باشند. رزين‌ها بايد داراي گروه‌هاي مبادله کننده تک عاملي باشند و درجه اتصالات عرضي کنترل شده داشته باشند . گستره اندازه ذرات نيز بايد تا آنجا که ممکن است کوچک باشد . با اين روش کروماتوگرافي مي‌توان محلول‌هاي رقيق را به خوبي جداسازي کرد .
کروماتوگرافی تعویض یونی بر پایه برهمکنش متقابل بار- بار بین پروتئینهای نمونه و مجموع بار رزینی که انتخاب شده , می باشد . کروماتوگرافی تعویض یونی به کاتیون اکس چنج کروماتوگرافی که بار مثبت یونها در آن با بار منفی رزین باند می شود وآنیون اکس چنج کروماتوگرافی که بار منفی یونها با جمع بارهای مثبت گروه وابسته به رزین باند می شود . یک مرتبه توسط محلول معین , ستون شسته می شود تا به تعادل برسد . این محلول , بافر آغازین نامیده می شود که باید قدرت یونی کمی داشته باشد . سپس با استفاده از بافر دومی که دارای شیب غلظتی است و به طور پیوسطه قدرت یونی آن بالا می رود , مولکولهای معین شسته می شوند . پیوسطه PH بافر شوینده اصلاح می شود و پروتئینی که بار آن با ماتریکس اثر متقابل ندارد , شسته می شود . اگر PH مورد نیاز برای run کردن نمونه را بدانید , می توانید نوع کروماتوگرافی تعویض یونی لازم برای منحنی توالی پروتئین را تعیین کنید . اگر در PH مورد نظر , بار پروتئین منفی است , از تعویض کننده بار منفی ( آنیون اکس چنج ) و اگر مثبت است , از تعویض کننده مثبت ( کاتیون اکس چنج ) استفاده کنید . در اکثر حالتها , ممکن است بهتر باشد که شرایطی را انتخاب کنیم که در آن شرایط پروتئین مورد نظر ما از میان ستون جریان یابد و سایر پروتئین های اضافه با ستون باند شوند . این سبک از باند شدن را جریان سراسری می نامند . این سبک برای آنیون اکس چنج بسیار خوب است . از این سبک می توان برای باند شدن اندوتوکسین و یا موادی که بار بسیار بالایی دارند و همزمان جریان پروتئین شما از میان ماتریکس مورد نظر , استفاده کرد .

آنیون اکس چنج کروماتوگرافی :بار خالص سطحی محلول ( پروتئین ها , اسیدهای نوکلوئیک , اندوتوکسین ) وقتی که باند می شوند ؛ منفی است . بنابراین برای باند شدن پروتئین ویژه ای باید , بالای نقطه ایزو الکتریک پوینت ( PI ) آن پروتئین باشیم . رزین های معمول برای آنیون اکس چنج کروماتوگرافی عبارتند از Q-resin و DEAE resin .

آنیون اکس چنج کروماتوگرافی عمدتا اولین کروماتوگرافی استفاده شده می باشد . به خاطر ظرفیت زیاد , ( این ماتریکس ها می توانند به 10 تا 100 mg پروتئین برای هر ml ژل باند شوند ) . و توانایی باند شدن و جداسازی اسید نوکلوئیک ها و لیپو پلی ساکاریدها از محلول اولیه . به طور نمونه AEC انجام شده در بافرهایی که PH آن بین 7 تا 10 است و جاری شدن یک گرادیانت از یک محلول که محتوی این بافر و محلول NaCl 1M است . نمک در محلول برای باند شدن با سطح ماتریکس در رقابت است و باعث رها شدن پروتئین هایی که باند شده اند می شود . از AEC در موارد زیر استفاده می شود : شستشوی اولیه نمونه آبکی , جدا کردن پروتئین از دیگر پروتئین ها , تغلیظ پروتئین و جدا کردن اندوتوکسینی که دارای بار منفی است از نمونه

کاتیون اکس چنج کروماتوگرافی :بار خالص سطحی محلول ( پروتئین ها , اسیدهای نوکلوئیک , اندوتوکسین ) وقتی که باند می شوند ؛ مثبت است . بنابراین برای باند شدن پروتئین ویژه ای باید , زیر نقطه ایزو الکتریک پوینت ( PI ) آن پروتئین باشیم . رزین های معمول برای کاتیون اکس چنج کروماتوگرافی عبارتند از S-resin و CM resin .

CEC در مقایسه با AEC کمتر معمول است . این به خاطر این است که اغلب پروتئین ها در PH های زیادی به این رزین نمی چسبند و میلی به تیتر شدن ندارند . با این وجود برای جداسازی اولیه , از نظر ظرفیت بالای آن , با AEC برابری می کند . به طور نمونه CEC انجام شده در بافرهایی که PH آن بین 4 تا 7 است و جاری شدن یک گرادیانت از یک محلول که محتوی این بافر و محلول NaCl 1M است. از CEC در موارد زیر استفاده می شود : شستشوی اولیه نمونه آبکی , جدا کردن پروتئین از دیگر پروتئین ها , تغلیظ پروتئین و گامی اولیه در تخلیص پروتئین های ویژه ای که تحت شرایط اسیدی هستند .

بافرهایی که در کروماتوگرافی آنیون اکس چنج مورد استفاده قرار می گیرد :



بافرهایی که در کروماتوگرافی کاتیون اکس چنج مورد استفاده قرار می گیرند :

سیستم AEC :Tris 20 mM ,PH=8.0 :بافر A
Tris 20 mM ,NaCl 1 M ,PH=8.0 :بافر B
1- ستون با بافر A به تعادل می رسد .
2- پروتئین(نمونه) دیالیز شده در بافر A به ستون می چسبد .
3- ستون توسط یک گرادیانت خطی که از 100% A تا 100% B تغییر می کند , شسته می شود .

سیستم CEC :sodium acetate 30 mM ,PH=4.5 :بافر A
sodium acetate 30 mM ,NaCl 1 M ,PH=4.5 :بافر B
1- ستون با بافر A به تعادل می رسد .
2- پروتئین(نمونه) دیالیز شده در بافر A به ستون می چسبد .
3- ستون توسط یک گرادیانت خطی که از 100% A تا 100% B تغییر می کند , شسته می شود .

سیستم AEC برای پروتئین هایی که انحلال پذیری کمی دارند یا PI خیلی بالایی دارند :
Ethanolamine 30 mM ,urea 8 M ,PH=10.0 :بافر A
Ethanolamine 30 mM ,urea 8 M ,NaCl 1 M ,PH=10.0 :بافر B