به خاطر تفاوت در ماهیت و ساختار در انواع نمونه ها , روشهای آماده سازی برای نمونه هایی که از منابع مختلف به دست می آیند , با هم اختلاف دارند . در ذیل این مقاله ، این نمونه ها را به انواع مختلف تقسیم بندی کرده ، در مورد آن توضیح می دهیم .
1- نمونه های محلول :
نمونه های محلول و مایع نظیر ، سرم ، پلاسما ، مایع نخاعی و عصاره مایع سلولها و بافتها را می توان در اکثر موارد با کمترین تغییر و دستکاری ، توسط الکتروفورز 2 بعدی بررسی و مطالعه کرد .
نمونه هایی مانند سرم و پلاسما را که دارای غلظت بالایی از پروتئین ها هستند ؛ را می توان با رقیق سازی توسط بافرهای محلول کننده مناسب ، برای انجام تست الکتروفورز 2 بعدی آماده کرد . در این روش بالا بودن غلظت بعضی از پروتئین ها ، مثل آلبومین و یا ایمونوگلوبین ها ، می تواند باعث پوشاندن بعضی از پروتئین ها که غلظت کمی دارند گردد . با خارج کردن این پروتئین ها می توان این مشکل را از بین برد . اما با خارج کردن این پروتئین ها ممکن است ، بعضی دیگر از پروتئین ها نیز خارج گردد .
2 موضوع دیگر نیز ممکن است ، در الکتروفورز 2 بعدی ایجاد مشکل نماید .
1- وجود نمک های اضافی در محلول
2- غلظت کم پروتئین ها در محلول
مشکل اول را می توان با دیالیز نمونه و یا کروماتوگرافی با sephadex G25 حل کرد و نمک های اضافی را از نمونه خارج کرد . مشکل دوم را می توان با رسوب دادن پروتئین ها ، به وسیله موادی که باعث رسوب کردن آنها می شود ، حل کرد . موادی مثل ؛ آمونیوم سولفات ، TCA ، یا استن . همچنین می توان با خارج کردن آب از نمونه ، آن را غلیظ کرد . مثل دیالیز در مقابل پلی اتیلن گلایکول و یا لیوفیلیز کردن نمونه .
رسوب دادن نمونه با استن – TCA برای غیر فعال کردن پروتئاز ها و خارج کردن مولکولهای تداخل کننده و برای تغلیظ پروتئین های بسیار قلیایی ، مثل پروتئین های ریبوزومی ، در محلول لیز شده سلولی بسیار مفید می باشد .
2- نمونه های بافتی :
برای تهیه نمونه از بافت جامد , معمولا بافت را توسط بافر محلول کننده ، حل می کنند . بهترین روش استفاده از نیتروژن مایع است . نمونه های کوچک را که در یک فویل آلومینیومی قرار دارد و در نیتروژن مایع , یخ زده است ، را می توان به راحتی در یک هاون خرد کرد . نمونه های بزرگ را می توان با هموژنه کردن در بافر محلول کننده ، توسط هموژنایزر آماده کرد . برای اینکه بتوان از آسیب پذیری پروتئین ها در اثر حرارت جلوگیری کرد ، باید حرارت تولید شده توسط هموژنایزر را از محیط نمونه خارج کرد .
مشکل خاص در آنالیز نمونه های بافتی ، عدم وجود یک دستی در ماهیت بافت است . همانطور که می دانیم بافت ها از انواع مختلف سلول تشکیل شده است . حتی یک نوع سلول نیز ممکن است از اختلاط سلولهای سالم و ناسالم تشکیل شده باشد . روشهای مختلفی برای جداسازی و تفکیک این سلولها وجود دارد . با استفاده از گزینش مثبت یا منفی و معمولا بر اساس یک روش ایمونوافینیتی ، امکان غنی سازی یک سلول خاص از جمعیت کل آنها و کشت آن قبل از انجام تست وجود دارد . همچنین از روشهای میکروسکوپی مانند (Laser Capture microdessection LCM ) نیز می توان برای جداسازی آنها استفاده کرد .
البته روش LCM برای آنالیز اسیدهای نوکلئیک بهتر است ، چون در کنار آن از PCR برای تولید و تقویت اسیدهای نوکلئیک استفاده می شود ، اما در آنالیز پروتئین ها ، دستگاهی که کار PCR را انجام دهد و پروتئین ها را افزایش دهد ، وجود ندارد .
3- نمونه های سلولی :
نمونه هایی که در محیط آزمایشگاه به صورت سوسپانسیون رشد داده می شود و یا نمونه هایی مانند خون ، لنفوسیتها و غیره را سانتریفوژ کرده ، توسط PBS (بافر فسفات سالین) شستشو کرده و در بافر محلول کننده حل می نمایند .
سلول هایی که در محیط جامد کشت داده می شوند را ابتدا باید از محیط کشت جدا کرد . قبل از جدا کردن سلول ها بهتر است آنها را با یک بافر ایزوتونیک شستشو کرد . برای این منظور محلول ایزوتونیک سوکروز پیشنهاد می گردد . زیرا یونهای موجود در بافر PBS ممکن است در نتیجه الکتروفورز تأثیر منفی گذاشته و تداخل ایجاد نماید . در صورت استفاده از PBS می توان نمونه را قبل از انجام تست ، دیالیز کرد . پس از شستشو سلول ها را توسط لوپ یا اسکراپر برداشته و در بافر محلول کننده حل نمایید .
در صورتی که نمونه حاوی مقادیر زیادی اسید نوکلئیک باشد ، ویزکوزیته آن بالاست . در این مورد می توان از RNase و DNase استفاده کرد .
هیچ نظری موجود نیست:
ارسال یک نظر