افینیتی کروماتوگرافی

افینیتی کروماتوگرافی :افینیتی کروماتوگرافی یکی از روش های جداسازی نمونه های پروتئینی است که خیلی زیاد مورد استفاده قرار می گیرد و بسیار گزینش پذیر و مؤثر است . این تکنیک بر پایه اثرات متقابل منحصر به فرد موجود بین یک مولکول و یک لیگاند متصل به یک ماتریکس است .

کارهای لازم برای طراحی یک افینیتی کروماتوگرافی عبارتند از :1- پیدا کردن یک لیگاند که ویژگیهای کافی داشته باشد .
2- پیدا کردن شرایط مناسبی که در آن لیگاند و پروتئین هدف به هم متصل شوند . همچنین به همان راحتی هم بتوانند از هم جدا شوند .

مراحل کار با کروماتوگرافی افینیتی را می توان به 3 مرحله اصلی تقسیم کرد .

1-Equilibration :

اولین قدم در کروماتوگرافی افینیتی آماده سازی فاز ساکن است . فاز ساکن معمولا ترکیبی است حل نشدنی از یک پلیمر هیدروفوبیک , برای مثال , آگاروز . باید این فاز را با بافرهای لازم به تعادل رساند و شرایط را برای چسبیدن پروتئین هدف آماده کرد .

2-Application of Sample :

در یک نمونه که حاوی انواع مختلف پروتئین می باشد , پروتئین هدف جلب فاز ساکن می شود , به آن متصل می شود و سایر پروتئین ها به راحتی از میان فاز ساکن عبور می کنند و شسته می شوند . موفقیت این بخش , به مقدار توانایی مولکول هدف برای متصل شدن به لیگاند بستگی دارد . ثابت تفکیک (KD) وابسته است به مقدار نیروی موجود بین مولکول هدف و لیگاند . (KD) کمتر یعنی پیوند قویتر . مقدار (KD) بین 10 به توان 4- و 10 به توان 6- ایده آل برای متصل شدن پروتئین هدف و فاز ساکن می باشد . اگر (KD) بسیار بزرگ باشد , پروتئین هدف به ستون نمی چسبد . اگر (KD) خیلی کوچک باشد , پروتئین هدف به سختی به لیگاند ها متصل می شود و به صورت برگشت ناپذیر جذب آن می شود . در طی شستشو , به استثنای پروتئین هایی که محکم به فاز ساکن چسبیده اند , اغلب مولکولهایی که دارای اثرات متقابل ضعیف هستند , توسط مثلا , یک محلول حاوی غلظت بالای نمک , شسته می شوند .

3-Elution :

به دنبال شست و شو در مرحله آزاد سازی پروتئین ها به صورت یک باند از فاز ساکن جدا می شوند . پس از اینکه نمونه هدف به فاز ساکن چسبید , گرادیانت بافر لازم است . در کروماتوگرافی افینیتی باید شرایط چسبیدن و شرایط رها شدن به راحتی فراهم شود .

2 راه برای شست و شوی مولکول هدف از فاز ساکن وجود دارد .

1- تغییرمقدار (KD) از کم به زیاد . مقدار (KD) ایده آل برای شست و شو معمولا بین 10 به توان 1- و 10 به توان 2- می باشد . همچنین مقدار (KD) می تواند با تغییر شرایط عوض شود . شرایطی مثل غلظت نمک , PH و دما .

2- اضافه کردن ماده ای که به عنوان رقیب به لیگاند متصل شود و باعث آزادی پروتئین هدف شود . یا ماده ای که به عنوان رقیب به پروتئین هدف متصل شود و همراه آن , به وسیله بافر از ستون و فاز ساکن شسته شود .

شکل شماره 2 : آزادسازی پروتئین های هدف به وسیله پروتئین های رقیب

شکل شماره 3 : آزادسازی پروتئین های هدف به وسیله لیگاندهای رقیب

مولکولهای هدف :
3 گروه از مولکولهای هدف وجود دارند که می توان در آن از روش افینیتی کروماتوگرافی استفاده کرد .

1- اتصالات ویژه مستقر بر روی مولکولهای زیستی فعال : این مولکولها شامل رسپتور , آنتی بادی وآنزیم های فعال می باشند . این مولکولها توسط لیگاندهای طبیعی خود یا لیگاند های شبیه به آن مورد استفاده قرار می گیرند .

2- گروههای مصنوعی که روی مولکولهای طبیعی قرار گرفته اند : برای مثال پلی ساکارید ها . این کار برای جداسازی گروهی آن سودمند است .

3- مولکولهای مهندسی شده که شامل یک برچسب افینیتی است : برای مثالی از این نوع برچسبها GST مخفف Glutathione-S-Transferase یا پروتئین هایی با هیستیدین قابل دسترسی . این برچسب ها اکثرا مهندسی شده تا پروتئین ها جداسازی شوند .

لیگاندهایی که فقط مخصوص یک مولکول خاص باشند را کمتر می توان به صورت یک ماتریکس تجاری پیدا کرد . لیگاندهایی که برای یک گروه خاص استفاده می شوند معمولا به صورت تجاری قابل دسترس هستند , زیرا بیشتر مورد استفاده قرار می گیرند . لیگاندهای کوچک تر ممکن است در بدست آمدن نتایج مشکلاتی را به وجود آورند . یکی از آنها تداخل شکل فضایی است .دیگر مشکل عدم دستیابی به لیگاند است .

شکل شماره 4 : وقتی لیگاند یک فاز ساکن تهیه می شود , اغلب لازم است که دارای یک بازوی بلند باشد , تا مانع از تداخل و اتصال مولکول و لیگاند نشود .