این وبلاگ شما را در رابطه با طرحهای تخلیص پروتئین یاری خواهد کرد .
مواردی چون آموزش ؛ مشاوره و مشارکت در طرحهای تحقیقی و
تولیدی و پایان نامه های دانشجویی
(وابسته به مؤسسه تحقیقات واکسن وسرم سازی رازی ، کرج)
متآسفانه در اکثر سایتها و وبلاگها فقط به کلیات اشاره شده است و اکثرا کپی برداری بوده و هیچ اثری از عملیاتی شدن کارها به چشم نمی خورد . ما بر آنیم که در این سایت شما را با روشهای جداسازی پروتئین آشنا کنیم . روشهایی همچون انواع اندازه گیری پروتئین ها , انواع کروماتوگرافی , انواع الکتروفورز و روشهای تخلیص پروتئین . ما در آموزش حداکثر توان خود را به کار خواهیم بست . آموزش های خود را در قالب SOP خواهیم داد .البته این آموزشها برای کسانی سودمند خواهد بود که رشته تحصیلی آنها مرتبط باشد . زیرا انجام یک پروسه تخلیص , علم و تجربه آن را خواهد طلبید . گمان نشود که با اندکی اطلاعات بتوان یک پروسه تخلیص را به پیش برد . ما در پروسه های تخلیص پروتئین با بیش از 7 سال تجربه و مشارکت با شرکت ها و مؤسسه های مختلف و با کوله باری از تجربه کنار شما خواهیم بود و در امر آموزش , مشاوره و شرکت در طرحهای تحقیقاتی و تولیدی و پایان نامه های دانشجویی شما را یاری خواهیم نمود .
ما بر آنیم که این سایت را منبعی از اطلاعات به روزگردانیم , تا کاربران بتوانند از اطلاعات و مقالات آن استفاده نمایند .
همچنین از مقالات جدید شما دوستان فرهیخته و دانشجویان گرامی پس از بررسی مطالب آن , با ذکر نام فرد و یا گروه , با حفظ حقوق مادی و معنوی آن , استفاده خواهیم کرد و بهترین مقالات و مطالب علمی را معرفی خواهیم نمود.
۶۳ نظر:
سلام...
من دانشجوی کارشناسی ارشد بیوشیمی هستم... میشه بدونم شما در چه مرکز یا دانشگاه یا ازمایشگاهی کار می کنید؟
با سلام
از تأخیر به وجود آمده در ارسال جواب پوزش می طلبم . این سئوال را بعضی از دوستان پرسیده اند , اما بنده به علت پاره ای از مسائل , تمایل چندانی به ارتباط این وبلاگ و محل کار خود ندارم . به هر حال جواب به این پرسش منوط به هدف شما از ذکر این سئوال می باشد .
از شما به خاطر ، مطالب خوب و ارزشمندی که در این وبلاگ گذاشته اید ، تشکر می کنم .
با توجه به تجربیات شما در زمینه خالص سازی پروتئین ها ، بنده خواهان ارتباط تنگاتنگ با شما در این زمینه می باشم .
اگر شما مایل باشید در دو طرح تولیدی مشاور و راه گشای ما باشید ، کمال امتنان را خواهیم داشت .
با تشکر
دکتر موسوی
سلام<وبا عرض خسته نباشید من کاراموز اداره ی استاندارد استان سمنان هستم و برای گزارش کار پایانی خودم موظف به تهیه ی گزارشی از نحوه ی اندازه گیری پروتئین متداول در صنعت هستم .به همین خاطر نیاز به کمک شما در این زمینه دارم اگر مقدور میباشد منو در این زمینه یاری کنیدوبا تشکر رمضانی
با سلام
کاربر گرامی mahtab خانم
روشهاي گوناگوني براي سنجش پروتئين مواد غذايي وجود دارد كه با توجه به تعداد نمونه،نوع نمونه ،سرعت عمل اندازه گيري مي توان هر يك را به كار برد. روش ماكروكلدال در مقايسه با ساير روشها ساده تر و دقيق تر بوده و به عنوان يك روش استاندارد مورد قبول است .در این روش دستگاه کجلدال نیاز است .در صورت نیاز به توضیح این روش به بنده اطلاع دهید.
با تشکر
مدیر وبلاگ
سلام من میخواستم برای پایان نامه کارشناسی ارشدم پروتئومیکس کار کنم ولی همه می گن خیلی سخته و من می ترسم میشه منو راهنمایی کنین
کاربر گرامی خانم رها
با سلام
همه کار ها سخت هستند.
اما اگر مایل بودی می توانم شما را در کرج - موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی با کسانی که در این زمینه کار می کنند ، آشنا کنم
البته این رشته بسیار شیرین است و ارزشمند .
سلام. برای افزایش پیج رنک علاوه بر مواردی مثل آپ کردن مداوم و منظم موارد دیگه ای هم مهمه. مثل اینکه مطالب کپی پست نباشه، بازدید کننده های وبلاگتون زیاد باشه، لود شدن وبلاگ طول نکشه و گرافیکش خوب و فونت ها مناسب باشه، لینک هاتون زیاد باشه و لینک های مرتبط خیلی امتیاز آوره مثلا لینک شما برای من خیلی ارزشمنده ولی لینک یه وبلاگ عشقی یا ادبی یا خانوادگی یا شخصی واسه وبلاگ من امتیاز آور نیست. پس هرچه با وبلاگهای علمی و اون هم هم موضوع خودتون تبادل لینک کنید براتون بهتر. مواردی مثل آهنگ برای وبلاگ یا امکانات جانبی مثل فال حافظ و بازی های آن لاین و ... ظاهراً امتیاز منفی دارند، این که چه قدر سرچ بشید و تو سرچ ها بالا بیاید براتون امتیاز داره و خیلی موارد دیگه.
البته بعضی مواقع پیج رنک گوگل به عقل جور درنمبیاد. مثلا وبلاگ خانوادگی ما که خیلی مطالبش کپی از سایر وبلاگ ها و سایت هاست خیلی زودتر از وبلاگ خودم که 90% مطالبش رو خودم تایپ می کنم به پیج رنک 3 رسید!!!
شاید اگه آدم بهش توجه نکنه و سعی کنه در حد مقدور بعضی موارد بالا رو رعایت کنه بهتر باشه. شایدم خودش خواه ناخواه بهبود پیدا کنه
به هر حال این مواردی بود که به ذهن من رسید.
سلام خسته نباشید
ممنون از مطالب مفیدتان اما اگر امکان دارد در ارتباط با الکتروفورز (به ویژهsds)توضیحی هم درمورد تهیه بافرها(بافر نمونه و بافر الکترود)بفرمایید چون این موارد در سایر منابع بسیار ناقص آمده اند و میزان دقیق حجمی یا وزنی اجزای تشکیل دهنده شان مشخص نشده است مثلا نوشته شده تریس بیس 25 میلی مولار اما گفته نشده چقدر. باتشکر
دوست عزیز و کاربر گرامی
در مورد محلول های مورد نیاز برای sds page
در قسمت موضوعات این مطالب را آورده ام . عنوان پست محلولهای مورد نیاز برای SDS PAGE می باشد.
با کمال تشکر
ابوذر عسکری
سلام
من شمارو لینک کردم از وبلگ ما هم دیدن فرمایید؟؟؟؟؟
http://www.nanobioradtech.blogfa.com
با سلام
ممکن است بفرمایید برای تهیه بافر استخراج پروتئین ( فسفات پتاسیم و سدیم متابای و آب) تا چه حد دقت لازم است؟ چون تجهیزات و لوازم آزمایشگاه اغلب دانشگاه ها ناخودآگاه 2-3 سی سی
(مزورها)و یا یکی دو قطره(سمپلرها)کم و زیاد می شوند و دانشجو در غالب موارد قادر به تکرار ویا تصحیح نمی باشد مثلا من هنگام به حجم رساندن بافر استخراج 2 سی سی آب بیشتر ریختم( درحجم 25 سی سی)و زمانی که پس از سانتریفیوژ عصاره ی پروتئین را با گلیسرول مخلوط میکردم از سمپلر هزارم که روی 350 تنظیم شده بود هر بار قطره ای می چکید، به نظر شما نمونه هایم ارزش الکتروفورز را دارند یا باید دوباره تهیه کنم؟ سپاسگزارم
با سلام
فکر نمی کنم از لحاظ کیفی مشکلی پیش آید ، اما از لحاظ کمیت ،ممکن است.
اما اینکه از سمپلر شما ، قطره قطره می چکد ، باید سر سمپلر را تا جایی که امکان دارد محکم کنید .
اگر مشکل حل نشد ، باید آن را باز کرده و تمیز کرده و گریس مخصوص آن را استفاده کنید.
در ضمن باید سمپلر ها هر چند وقت یک بار کالیبره شود.
معمولا سمپلر ها در انتهای خود یک پیچ تنظیم کننده دارند ، که در زیر یک لاستیک وجود دارند.
برای کالیبره کردن آن باید از یک ترازوی دقیق استفاده کرد. سمپلر را روی 1000 تنظیم کنید و به وسیله آن یک حجم از آب مقطر را وزن کنید . چون یک گرم آب مقطر یک ام ال است
پس وزنی که ترازو نشان می دهد ، باید
1000 میلی گرم باشد . 3 بار این کار را به یک روش انجام دهید . اگر میانگین آنها کمتر بود یا بیشتر بود می توانید با پیچ تنظیم کننده ، آن را تغییر دهید و کالیبره نمایید.
با تشکر
ابوذر عسکری
از راهنماییتان در مورد سمپلر خیلی ممنونم،امیدوارم موفق باشید.
باسلام
من دانشجوی ارشد بیوشیمی هستم و میخواهم در مورد روشهای استخراج اسید نوکلئیک تحقیق کنم.لطفا راهنماییم کنیدو آگر مطلبی دارین خوشحال میشم کمکم کنید
باتشکر
کاربر گرامی tara بنده در زمینه کار نکردم . اما در اینترنت قبلا مطالبی در مورد استخراج DNA سلولهای درون دهان دیده ام.
سلام
دانشجوی ارشد سلولی هستم و قراره به تازگی روی پروتئومیکس باکتری کار کنم.استخراج پروتئین از باکتری چه تفاوت هایی با بافت های دیگه داره؟ایا مطلبی در این زمینه دارین که به من کمک کنه؟
با تشکر
کاربر گرامی خانم بنفشه
در استخراج پروتئین از باکتری باید توجه داشته باشید که پروتئین داخل سیتوپلاسم است یا نه ، به صورت ترشحی در خارج آن است . این امر باعث می شود که در متد استخراج تفاوتهایی حاصل شود.
اگر در داخل بود :
باید دیواره سلول به وسیله عوامل شیمیایی یا فیزیکی شکسته شود.در مرحله بعد باید اجسام باکتری را از نمونه خود جدا نمایید .سپس میتوانید توسط متدهای رسوبدهی پروتئین و کروماتوگرافی ،آن پروتئین را جدا کنید.
اگر در خارج باشد :
به خاطر تنوع پروتئینی کمتر و نبود مرحله شکست سلول باکتری کار کمی راحت تر است . بعد از کشت باکتری ، نمونه را توسط سانترفوژ یا صافی ، صاف می کنید و دوباره از متدهای رسوب دهی پروتئین و کروماتوگرافی ، برای جداسازی پروتئین استفاده می نمایید.
اگر پروتئین در بافت باشد ، حتما قبل از هر کاری بافت را به وسیله عوامل فیزیکی خرد کرده و سپس توسط عوامل شیمیایی آن را هضم نمایید . سپس مابقی کار را، مثل رسوبدهی پروتئین و کروماتوگرافی را روی این شیرابه انجام می دهید.
در صورتی که نوع کار خود را بیشتر توضیح دهید ، اطلاعات بیشتری به شما خواهم داد.
با تشکر
واقعا از شما ممنونم که با حوصله به سوال ها جواب میدین.راستش ما قراره یه کار پروتئومیکس روی مایکوباکتریوم توبرکلوسیز انجام بدیم.فعلا داریم روی متد ها کار میکنیم.اینکه از چه روش هایی میتونیم برای شکستن دیواره باکتری یا مراحل دیگه استخراج پروتئین استفاده کنیم که کمترین اثر منفی رو روی 2DE داشته باشه.ببخشین من واقعا اطلاعات کمی در این زمینه دارم.اگه بتونید منبعی رو بهم معرفی کنید یا خودتون کمکم کنید ممنون میشم.
لطفا کمک کنید(بنفشه)
خانم بنفشه
با سلام
از وقفه ای که در پاسخ ایجاد شد عذر می خواهم.
برای شکستن جداره باکتری
1- از دمای پایین مثلا 70 -80 درجه زیر صفر استفاده می شود.
2- از امواج رادیویی دستگاه سونی کاتور نیز استفاده می شود.
3- از مواد شیمیایی نظیر آنزیمهایی مثل تریپسین استفاده می شود.
می توانید برای بهبود شکستن جداره به طور دلخواه ، 2 روش از روشهای بالا را انتخاب کرده و با هم استفاده نمایید.
پس از شکستن جداره باکتری ، نمونه موجود را سانتریفوژ و یا فیلتر کنید.
بقیه کار ، با توجه به این که جرم مولکولی پروتئین شما چقدر است و بار آن چه میزان است ، طراحی می شود.
برای اینکه ابتدا پروسه را به پیش ببرید و مقداری از تنوع پروتئینی نمونه و سایر مولکولهای مزاحم را، مانند چربی ها و غیره را ، از محیط بیرون ببرید ، لازم است از متد ترسیب پروتئین (رسوب پروتئین) که معمولا از آمونیوم سولفات استفاده می شود ، این کار را انجام دهید.
ابتدا (معمولا) کات 20% استفاده کنید.(باید مطمئن شوید که در این کات پروتئین شما رسوب نمی کند).در این حالت خیلی از پروتئین ها به صورت رسوب در می آید. رسوب ها را از محیط به توسط سانتریفوژ و یا صافی جدا کنید .حال لازم است که از کات بالاتری مثلا 70 یا 80 درصد استفاده کنید.(در این حالت باید تست بگذارید و مطمئن شوید که دیگر در محلول شما ، پروتئین مورد نظر شما نیست و همه آنها رسوب کرده اند)
حال که تنوع پروتئینی شما کمتر شده است ، می توانید از یک ستون کروماتوگرافی آیون اکس چنج (با توجه به بار پروتئین مورد نظر شما ، از آنیون اکس چنج و یا کاتیون اکس چنج )استفاده نمایید.نام ژل کروماتوگرافی با توجه به نوع پروتئین و رفتارهای آن در محیط های اسیدی و یا قلیایی انتخاب می شود و متغیر هایی مانند سرعت کروماتوگرافی نیز مهم هستند.
در این مرحله طیف وسیعی از پروتئین های اضافی جدا می شود .
در مرحله آخر از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون استفاده کنید.این مرحله به شما کمک می کند تا پروتئین را به صورت خالص به دست آورید.
این مراحل را توصیه می شود در دمای پایین ، مثلا cold room استفاده نمایید.
این روشها کلی ذکر شده است و نمی دانم چقدر شما با پروتئومیکس و بخصوص کروماتوگرافی آشنایی دارید، اما روشهایی که ذکر شد از سیف ترین روشها است که به پروتئین آسیب نمی زند.
ضمنا باید یک تست برای شناسایی پروتئین خود داشته باشید ، تا بتوانید در مراحل مختلف از وجود و یا عدم وجود و مقدار پروتئین مورد نظر خود آگاهی پیدا کنید.
در ضمن منظور شما را از 2de متوجه نشده ام
با تشکر
سلام
مرسی
راستش تصمیم داریم از bead برای شکستن جدار باکتری استفاده کنیم.منظورم الکتروفورز 2بعدی بود.
ببخشید میشه روش تعیین غلظت پروتئین در 280 نانومتر رو برام توضیح بدین؟
مرسی
با سلام
کاربر گرامی خانم بنفشه
شما برای کار بر روی پروتئین ها و انجام تست الکتروفورز 2 بعدی ، باید عوامل مزاحم ، مانند چربی ها و سایر مولکولهای مزاحم را از محیط حذف نمایید و آنزیم هایی که در نمونه وجود دارند به وسیله مواد شیمیایی مخصوص غیر فعال کرده و کل پروسه را در دمای پایین ترجیحا در سردخانه انجام دهید (به خاطر فعالیت کم آنزیم ها در دمای پایین ). پروسه را طوری طراحی کنید که پروتئین های شما از نمونه حذف نشود.
روش تعیین غلظت در 280 نانومتر زیاد دقیق نیست ، اما در خیلی از جاها به خاطر سرعت بیشتر انجام تست ،کاربرد دارد ، که در پایین توضیح می دهم.
روش اندازه گيري جذب در 280 نانومتر
اسيدهاي آمينه دارای حلقه های آروماتيک (به خصوص تريپتوفان و تيروزين و تا حد کمي فنيل آلانين) داراي جذب در 280 نانومتر هستند. ساختمان دوم، سوم و چهارم پروتئين بر جذب UV موثرند، در نتيجه عواملي چون pH, و قدرت يوني بر روی خصوصيت جذب UV پروتئين تاثير مي گذارند.
بعد از اندازه گيري جذب در 280 نانومتر، براي محاسبه غلظت از معادله زير استفاده مي شود:
عرض کووت(cm) / جذب در 280 نانومتر = غلظت (mg/ml)
ذکر اين نکته الزامي است که معادله فوق برای به دست آوردن تخمينی از غلظت پروتئين به کار مي رود، چرا که
پروتئين هاي متفاوت بنا به حضور تعداد اسيدهای آمينه با حلقه آروماتيک و ساختارشان خصوصيات و ضريب جذبي متفاوتي دارند.
در مورد محلولهاي پروتئيني خالص که ضريب جذب(absorbance coefficient) آنها مشخص شده است( مثلا" ضريب جذب BSA معادل 63 است)، درصورت استفاده از کووت هاي 1 سانتيمتري از معادله زير استفاده مي شود:
ضريب جذب در 280 نانومتر / جذب در 280 نانومتر =غلظت (mg/ml)
زمانيکه ضريب جذب مشخص نباشد بايد ابتدا از روی توالي اسيدهاي آمينه تعداد اسيدهاي آمينه تريپتوفان(W) ، تيروزين (Y)، و سيستئين (C) شمارش شده و در معادله زير قرار داده مي شود تا extinction coefficient بدست آيد.
e280 = 5690x(#W) + 1280x(#Y) + 60x(#C)
ميزان e محاسبه شده در معادله فوق برابر است با جذب 280 نانومتر محلول 1 مولار پروتئين مورد نظر در کووت 1 سانتي متري. با محاسبه اين ضريب براي يک پروتئين مي توان با تعيين جذب آن در 280 نانومتر مستقيما" غلظت آن را از فرمول زير تعيين کرد:
e280 x Mw/جذب در 280 نانومتر = غلظت (mg/ml)
تأکید می شود در نمونه خالص پروتئین e را به دست می آورید و در نمونه هایی که حاوی انواع مختلف پروتئین است لازم نیست .
در صورتيکه نمونه احتمال آلودگي به اسيدهاي نوکلئيک را داشته باشد، بعد از اندازه گيري جذب در 280 نانومتر، جذب محلول پروتئيني در 260 نانومتر هم اندازه گرفته مي شود و از معادله زير براي محاسبه غلظت پروتئين استفاده مي گردد:
جذب در 260 نانومترx 76/0- جذب در 280 نانومترx 55/1 = غلظت (mg/ml)
کاربر گرامی خانم بنفشه
شما همچنین می توانید از BSA به عنوان استاندارد در این تست استفاده نمایید
کاربر گرامی خانم بنفشه
به نظر بنده از روش 280-260 (بدون استفاده از استاندارد و یا با استفاده از استاندارد) بهتر است ، استفاده کنید.
سلام...خسته نباشید
ممنون میشم اگه بتونید منو راهنمایی کنید...ما میخواهیم روشی را پیدا کنیم که بتوانیم پروتئین ران شده بر روی ژل SDS psge یا اکریلامید را از روی ژل بریده و برداشته و جداسازی کنیم و به نحوی که بتوانیم آن پروتئین را به سیستم HPLC تزریق کنیم ممنون از راهنماییهای دوستان...
e.mail e man : hrnit84@yahoo.com
با سلام
hrnit84
ابتدا به بنده بگویید هدف شما از اینکه نمونه را به hplc منتقل کنید چیست؟
ایا کل نمونه را می خواهید به hplc منتقل کنید ، یا فقط یک باند را
در ضمن همانطور که می دانید در sds page پروتئین نمونه ها بر اساس جرم مولکولی از هم جدا می شوند . و پروتئین ها در اثر تغییر شکل دیگر قابلیت و فعالیت خود را از دست می دهند.
شما می توانید از الکتروفورز page یعنی به صورت native استفاده کنید و در این روش جداسازی پروتئین ها بر اساس بار و جرم مولکولی می باشد و پروتئین ها فعالیت خود را از دست نمی دهند .
همه مراحل مثل sds psge است اما در آن از sds و مرکاپتواتانول استفاده نمی شود و همچنین نمونه قبل از تزریق حرارت داده نمی شود .
اگر یک باند را می خواهید روی hplc ببرید ، باید باند مورد نظر خود را بشناسید ، که در این صورت اگر واکنشی برای شناسایی پروتئین دارید ، از آن استفاده نمایید . روی ژل 2 نمونه همسان لود کنید و ژل را نصف کنید . نصف ژل رادر واکنش گر انداخته تا جای باند مورد نظر را بشناسید. واز نصف ژل دیگر برای بریدن باند و استفاده برای hplc استفاده کنید. آن قطعه از ژل را در محلولی حل کرده و به hplc تزریق نمایید.
با تشکر
سلام خسته نباشید
اگر ممکنه بفرمایید در الکتروفورز عمودی(SDS-PAGE)چه مقدار لدر استفاده می شود؟ آیا میزان ثابتی دارد یا متناسب با میزان پروتئین لود شده، متفاوت است؟و در مخلوط نمونه و بافر که پیش از لود کردن سانتریفیوژ می شود فازی دیده نمی شود تا طبق پروتوکل از فاز رویی چند ماکرو برداریم، مشکل کجا می تواند باشد؟ و اینکه برای رنگ زدایی، حداکثر چه مدت ژل در محلول بماند؟ با تشکر
SH
دوست عزیز SH
با سلام
در الکتروفورز عمودی(SDS-PAGE)میزان sample buffer )لوودر متغیر و تجربی است و می توانید از 4:1 حجم نمونه پروتئینی (چهار برابر) تا 1:1 (هم حجم) استفاده کنید .
سانتریفوژ به خاطر وجود احتمالی رسوب است ، که اگر وجود ندارد ، خوب چه بهتر
مدت زمان برای رنگ زدایی باید طوری باشد که رنگ زمینه ژل از بین برود و این مدت برای روش کوماسی بلو حدود 2 الی 3 ساعت است و در طول این زمان چند بار محلول رنگ زدایی به ظرف حاوی ژل اضافه می شود و زمانی که رنگ محلول آبی شد و ژل را سخت توانستی ببینی ، محلول را عوض کنید و از محلول تازه استفاده کنید.
ضمنا ژل باید به صورت یک نواخت بر روی شیکر ، شیک شود.
با تشکر
سلام...خسته نباشبن...
عرض کنم از راهکارتان برای جداسازی نمونه و تزریق روی hplc ممنونم ولی اینکه با چه روش و موادی و چگونه نمونه را که در ژل هست جدا و تمیز کنم و شرایط تزریق روی ستون داشته باشه برام سواله.؟
حمید جان سلام
این مسئله خاصی نیست.
آن قسمت از ژل را که تشخیص دادی ، باند داره ،را از ژل جدا کن و در حجم خیلی کم (مثلا 100 الی 200(لاندا)میکرو لیتر)در آب و یا ترجیحا در بافری که مناسب برای تزریق Hplc و یا بافری که در آن پایداری پروتئین بهتر است ، قرار بده . به توسط یک وسیله که بتوان آن را خرد کرد ، ژل را ؛ خرد کن . یک الی نیم ساعت در یخچال قرار بده ، تا در دمای پایین ، پروتئین ها از ژل به بافر و یا آب مقطر نفوذ کند . سپس سانتریفوژ و بعد فیلتر کن.حال اگر توانستی ، بهتر است یکی ، دو بار ، در محلولی تازه از همان بافر آن را دیالیز کنی .حالا آماده برای تزریق است . اما اینکه باید دقت کنی که اگر پروتئین برای تزریق به hplc ،نیاز به بافر خاصی دارد ، از همان بافر در تمام مراحل استفاده کن.
سلام
ممنون از توضیحات قبلیتان، اگرممکنه بفرمایید میزان ladder مصرفی هنگام لود کردن نمونه هایی به حجم 30 یا 20 ماکرولیتر چقدر باید باشد؟و سئوال دیگر اینکه چرا محلول sds بیست درصدی که تهیه و اتوکلاو می کنم پس از 5-6 روز رسوب می دهد(محلول را به phنرساندم)و آیا استفاده از آن پس از گرم کردنش که دوباره شفاف شده است ، برای sds-page اشکالی ندارد؟یا باید دوباره تهیه شود؟ در ضمن شما گفته اید محلول آمونیوم پر سولفات 10% را می توان طولانی مدت نگهداری کرد اما در سایر منابع توصیه شده که تازه تهیه و استفاده شود، می توانم بپرسم آیادر تجربیات خودتان این دو حالت تفاوتی در نتیجه کار داشتند یا نه؟ با تشکر
sh
با سلام
دوست عزیز sh
شما برای آماده کردن نمونه ، و لود کردن آن ، باید 20 لاندا(میکرولیتر)از نمونه را با 80 لاندا لودر مخلوط نمایید. و پس از مخلوط کردن ، 20 لاندا از این نمونه را در چاهک بریزید.(در روش sds page لودر شما sds و مرکاپتو اتانول دارد و مخلوط را قبل از ریختن در چاهک 10 دقیقه حرارت می دهید.ولی در روش PAGE یا native لودر شما sds و مرکاپتو اتانول ندارد و نیاز به حرارت دادن نیست).
محلول sds معمولا در یخچال رسوب می کند. معمولا می گویند که تازه استفاده شود ، اما بنده آن را پس از خارج کردن از یخچال و قرار دادن در دمای محیط ، و چک کردن اینکه خراب نشده باشد و احیانا ذره نداشته باشد ، بدون هیچ مشکلی استفاده می کنم .و اینکه می گویید که اتوکلاو می کنید ، برای چه علتی است ؟ اگر می شود توضیح دهید.
در منابع ذکر شده است که آمونیوم پر سولفات تازه تهیه و استفاده شود .اما به دلیل سختی و همچنین خطرات احتمالی(سرطان زا بودن ) که در تهیه این محلول وجود دارد ، با شرایطی می توان از قبل آن را درست کرده باشید.
1- در دمای بسیار پایین باشد (فریز)
2- در میکروتیوب های یک ام الی جدا کرده باشید.
3- به آن نور نخورد.
پس شما می توانید مثلا 10ml از آمونیوم پر سولفات را درست کنید و بلا فاصله آن را به 10 میکروتیوب 1ml انتقال دهید. و همه میکروتیوب ها را در ظرفی که نور به آن نخورد قرار داده و ظرف را در فریزر بگذارید. هنگام نیاز به تعداد لازم از میکروتیوب ها را برداشته و استفاده نمایید ، اما مقدار اضافی را out کنید .
بنده از این روش استفاده می کنم و هیچ مشکلی پیش نیامده است .
به خاطر این می گویند تازه استفاده کنید ، چون این ماده در مجاورت نور رادیکال آزاد تولید می کند و این رادیکالها بسیار واکنش پذیرند . اگر شما از محیط آنها نور و گرما را حذف کنید ، دیگر رادیکال آزاد تولید نمی کند و پایدار باقی می ماند.
سلام خسته نباشید
ممنون از پاسخ کاملتان. علت اینکه sds را اتوکلاو می کنم ، نگهداری طولانی مدت آن است البته نمی دانم تا چه حد ضروری یا درست است؟ معمولا محلول هایی که می خواهیم طولانی مدت نگهداری کنیم مثل بافر فسفات پتاسیم و یا تریس هیدروکلراید را اتوکلاو می کنیم، اما در مورد sds محلول پس از 3-4 روز در دمای محیط حالت کلوئیدی(ابر یا رشته های سفید رنگ معلق در مایع شفاف)پیدا می کند که پس از قرار دادن در بن ماری و حرارت دیدن ،مجددا شفاف می شود و من در این حالت از آن استفاده می کنم( کارم اشتباه نیست؟).سئوال دیگری هم دارم اگر ممکنه بفرمایید آیا محلول رنگ آمیزی ژلsds قابلیت مصرف برای 2 یا 3 بار را دارد؟یعنی استفاده مجدد از این محلول که یکبار هم ژلی را رنگ آمیزی کرده، پس از یکی دو هفته، درست است؟ در ضمن اگر آزمایشگاهی فاقد هود موثری باشد به چه ارگانی باید مراجعه کنیم؟
باسپاس
sh
با سلام
جناب sh
به نظر بنده sds را اتوکلاو نکن . کم درست کن ، مثلا 5 الی 10 ml . تا نیاز به اتو کلاو نباشد.
برای شفاف شدن از بن ماری استفاده نکن . در دمای محیط به راحتی شفاف می شود.
اگر رنگ را در هنگام رنگ کردن ژل در ظرفی سر بسته استفاده کنید . بهتر است . چون مواد فرار آن خارج نمی شود .
به هر حال از آن می توانید ، بارها و بارها استفاده کنید و اگر احساس کردید بوی الکل یا اسید استیک آن کم شده می توانید ، مقداری به آن اضافه کنید ، اما اضافه کردن آنها باید متناسب باشد . اما همان روش اول یعنی جلوگیری از فرار مواد فرار ، یعنی استفاده از ظرفی که درب مناسب دارد ، بهترین گزینه است.(ظرف حاوی ژل ، در هنگام رنگ بری و ظرف نگهداری رنگ).
منظور شما را از مراجعه به ارگان متوجه نشدم .
سلام .خسته نباشید.سوالی درباره رسوب با سولفات آمونیوم داشتم.ما از محلول اشباع سولفات آمونیوم یک محلول 50% ساخته ایم.با اضافه کردن چه مقدار از محلول اشباع به این محلول 50%می توانیم آن را به 70% اشباع برسانیم؟
با تشکر فراوان
کاربر گرامی:
با سلام
بنده برای اضافه کردن درصد آمونیوم سولفات به محلول ، از اضافه کردن آن به صورت خشک استفاده می کنم .این روش در آمونیوم سولفات مصرفی صرفه جویی میکند .اما به صورت محلول را چون کار نکردم ، نمی دانم.
gr=533(s2-s1)/(100-0.3*s2)=gr/lit
در این فرمول s1 درصد اولیه و s2 درصد ثانویه می باشد .جواب بر حسب گرم بر لیتر نمونه شما به دست می آید. مثلا اگر حجم نمونه شما 200ml=0.2 litاست جواب را در 0.2 ضرب می کنیم.
باید آمونیوم سولفات را کم کم و به دفعات به محلول اضافه کرد و همزمان آن را مخلوط کرد و پس از حل شدن مقدار ریخته شده دوباره مقداری دیگر اضافه کنید و این کار را تا تمام شدن تمام آمونیوم سولفات تکرار نمایید .
با تشکر
سلام
بنده روي پروتئينهاي دانه زيتون كار ميكنم . براي اينكه ژل SDS PAGE داراي غلظتهاي مساوي از نمونه باشد به چه ترتيبي ميتوانم غلظت همساني از نمونه ها داشته باشم ؟ و بهتر ين ميزان غلظت نمونه كه بتوان نتاج خوبي هم روي ژل مشاهده كرد چقدر است ؟
با تشكر
با سلام
دوست عزیز
برای نونه گذاری بر روی ژل ، نمی توان یک غلظت خاص را بیان کرد و غلظت نمونه را با تکرار نمونه گذاری به دست می آورتد . به دلیل اینکه در یک نمونه که شامل پروتئین های مختلفی است ، و مقدار آنها نیز بسیار متفاوت است ، ممکن است غلظت یک پروئین بسیار کم و غلظت پروتئین دیگر در همان نمونه بسیار زیاد باشد . بدیهی است باید غلظت نمونه را طوری انتخاب کرد که همه باند ها قابل روئیت باشد .مثلا اگر از غلظت نیم میلی گرم پر ام ال BSA استفاده شود و نمونه فقط حاوی همین پروتئین باشد ، ممکن است باند خوبی دیده شود . اما اگر با همین غلظت برای نمونه ای که دارای پروتئین های متنوعی هست ، استفاده شود ، خیلی از باند ها دیده نشود . چون غلظت پروتئین شما شامل همه انواع پروتئین نمونه است که در باندهای متفامتی نشان داده می شود.
پس با گذاشتن چند ژل ، و با کم و زیاد کردن غلظت آن ، می توانید ، به بهترین حالت ممکن از غلظت پی ببرید .
با تشکر
سلام
ممنون از پاسختون . آيا با اندازه گيري ميزان جذب پروتئين از روش brad ford و بدست آوردن ميزان جذب ميتوان غلظت پروتئين را در نمونه بدست آورد و سپس از طريق تناسب يا محاسبات همسان سازي غلظت پروتئين نمونه ها را انجام داد ؟
باتشكر
سلام
یک متابولیت ثانویه از باکتری استرپتومایسس با اثر ضد میکروبی جداسازی کرده ام که هیچ اطلاعی از جنس واینکه چه ماده ای است ندارم و بنابراین استانداردی هم ندارم.در صورت امکان راهنمایی برای برای شناسایی و خالص سازی ان دارم؟
کاربر گرامی
با سلام
بله ، می توانید با به دست آوردن غلظت نمونه ها و رقیق سازی نسبی این کار را انجام دهید .
دوست گرامی
با سلام
در رابطه با متابولیتی که آن را عنوان کرده اید ، چند سئوال دارم .
اول در خصوص محیط کشت :
1- این که چه محیطی استفاده شده است .
2- ایا این ضد میکروب ، در همه محیطها از این باکتری تولید می شود ، یا نه می تواند اثر القایی محیط کشت شما باشد .
3- آیا مطمئن هستید که ، محیط کشت شما آلوده به میکرو اورگانیسم دیگری نبوده است .
جواب به این سئوالات می تواند تا حدود زیادی راهنمای کار و مشخص کننده ،آن ضد میکروب باشد .
ضمن اینکه باید در اینترنت جستجو کرده و در مورد این باکتری ، محیط های کشت و ضد میکروب های تولید شده توسط آن ، اطلاعات بیشتری به دست آورید . با این اطلاعات خیلی از ابهام ها رفع می شود .
سلام خسته نباشید
اگر ممکن است بفرمایید نقش سدیم متابای سولفیت که به بافر استخراج پروتئین
(بافر فسفات پتاسیم) اضافه می کنیم چیست؟ با تشکر
sh
باسلام
دربافت سبز گياهي و يا دانه چه روشي بمنظور تخليص پروتئين از كلروفيل و ليپيدها ميتوان بكار برد ؟
با تشكر
با سلام
ممنون ميشم اگه پاسخ من را بدهيد . بمنظور جداسازي پروتئين از دانه گياه سبز چه روشي را پيشنهاد ميكنيد كه بيشترين مقدار پروتئين را بتوان بدست آورد ؟
با سلام
سدیم متابای سولفیت خاصیت احیا کنندگی و غالبا به عنوان یک نگهدارنده مصرف می شود.در این کار بخصوص که شما فرموده اید ، احتمالا برای احیا کردن پروتئین هایی که به مولکولهایی مثل قند یا چربی ، چسبیده اند ، مصرف شده است . یا ممکن است که به خاطر خاصیت نگهدارندگی (جلو گیری از اکسید شدن مولکول) و ایجاد محیطی پایدار از آن استفاده شده باشد .
به هر حال چون اطلاعات گفته شده شما کم بود ، این نکات را نوشتم.
برای استخراج و جداسازی پروتئین از بافت گیاهی ، باید ابتدا دیواره سلول ها را از بین ببرید ، تا تمام پروتئین ها از داخل سلول به بیرون انتقال پیدا کند .
معمولا با توجه به امکانات ، مسیر خاصی را در نظر می گیرند . و هرچه قدر بهتر و کامل تر دیواره را از بین ببرید ، نتیجه بهتری می گیرید .
می توانید از نیتروژن مایع ، یا سردخانه -20 درجه یا بیشتر استفاده کنید. آنها را خرد کنید . عصاره راصاف کنید . عصاره را کات 20 درصد آمونیوم سولفات بزنید. و ادامه ماجرا
با سلام، بنده قصد استخراج پروتین را از میکروسپور دارم در روش استخراج من از مرکاپتواتانول استفاده می شود آیا ماده ای جایگزین آن وجود دارد؟
2- میکروسپورهای من در محیط کشت هستند که من آنها را برای استخراج استفاده می کنم وقتی بر روی آنها ازت مایع می ریزم جهت سابیدن آنها باز هم بعد از گذشت کمتر چند ثانیه به حالت مایع در می آیند اول اینکه این انجماد و یخ زدن های پیاپی ایرادی به کار وارد نمی کند ؟ دوم اینکه هنگام این که در پروتوکل مقالات مثلا اشاره می شود 100 میلی گرم بافت مورد نظر من به علت اینکه همراه نمونه هایم مقداری محیط است که همراه نمونه یخ زده است مثلا 500 میلی لیترگرم وزن می کنم آیا ایرادی ایجاد می شود؟
با سلام دوست عزیز
اول باید بدانم ، اینکه از مرکاپتواتانول استفاده می کنید ، به چه علت است و هدف از استفاده از آن چیست؟
1- انجماد پیاپی در این مورد ایرادی ندارد . از انجماد برای شکستن دیواره استفاده می شود .
2- اگر نمونه را از محیط کشت جدا کنید و سپس نمونه را وزن کنید ، بهتر است . اما اگر فکر می کنید که مقدار وزن شده شما تقریبا معادل مقدار مورد نظر است مشکلی ندارد .
با تشکر
سلام..
یادم نبود که یه بار دیگه هم اومدم اینجا...
جناب عسکری...
من می خوام دکترای پروتئومیکس شرکت کنم... ایا شما می تونید در این زمینه به من کمک کنید؟
نمی دونم برای مثلا درس پروتئومیکس بهترین کتابی که میشه مطالعه کرد چیست؟ یا درس های دیگر مثل بیوانفورماتیک...
ممنون میشم اگه در این زمینه کمکم کنید.
با سلام
خانم سودابه نیک نیا
در مورد کتاب ، کتابی که فارسی باشه ، بنده چیز قابل ملاحظه ای ندیدم . این را هم بگویم که دنبالش نبوده ام.
اصولا چون این رشته نو پاست ، منابع اکثرا به زبان اصلی می باشد . این کتابها را هم به اسانی نمی توان تهیه کرد . ولی به نظر بنده راحت ترین راه استفاده از خود اینترنت می باشد . با جستجو می توانید مطالبی پیدا نمایید.
با تشکر
سلام و خسته نباشید
ممکنه بفرمائید تغییرات غلظت پروتئین گندم(در گیاهچه ) در تنش (مثلا سرما) در چه رنجی است؟ من بارها و در چند آزمایشگاه اسپکت انجام دادم اما هر دفعه نتیجه متفاوتی گرفتم( برای یک نمونه واحد، یکبار 120 و دفعه بعد 11 بدست آمده) نمی دانم کدام قابل استناد است.آیا رفرنسی در این رابطه وجود دارد ؟ و سئوال دیگرم اینست که معمولا بردفوردهایی که در بازار هستند چند درصدند، متاسفانه روی شیشه چیزی ننوشته، آیا 100% هستند تا هرکس طبق نیاز خود رقیقش کند یا همه 20% هستند؟ با تشکر sh
دوست عزیز sh
در مورد این سئوال شما , چون آزمایش را روی یک نمونه انجام داده اید و احتمالا از محلولهای آماده برادفورد استفاده کرده اید چند مورد را می توانم یاد آور شوم.
1-امکان دارد اکسپایر( تاریخ انقضا محلول های شما سر رسیده باشد. یا محلول های شما در اثر عواملی مثل نور خراب شده باشد .
2-ممکن است در محاسبات رقیق سازی مرتکب اشتباهی شده باشید .
3- امکان دارد که رنج غلظت را رعایت نکرده باشید . همانطور که می دانید ، در تست های پروتئین رنج شناسایی وجود دارد . مثلا برای تست لوری باید غلظت پروتئین مورد آزمایش شما بین 0.1 mg/ml - تا 0.5 mg/ml باشد . تا نتیجه آزمایش و نمودار شما خطی باشد . در این مورد هم باید سرچ نمایید و بدانید که برای انجام تست برادفورد این رنج باید چقدر باشد . باید نمونه خود را به مقداری رقیق کنید تا داخل آن رنج باشد .
به علت تفاوت فاحش در یک نمونه آزمایشی ، تنها موارد بالا باید در نظر گرفته شود .
در مورد سئوال دوم شما بنده اطلاعاتی ندارم . و منظور و هدف شما را هم از اینکه می خواهید ، آنها را رقیق کنید ، متوجه نشدم . اما می توانید با یک سرچ در اینترنت محلول برادفورد را خودتان تهیه نمایید .
با تشکر
کاربران گرامی
با سلام
چندی است که عکس های موجود در وبلاگ نشان داده نمی شود . بنده در تلاش بودم که این نقص را بر طرف نمایم . اما در حال حاضر تلاش های بنده ثمری نداشته است . این ایراد مربوط به Blogger می باشد . یعنی سایتی که وبلاگ را پشتیبانی می کند . به هر حال سعی من این است که مشکل را مرتفع نمایم .
با تشکر
سلام،
آیا شما روشی برای اندازه گیری امینواسید آرژنین و گوانین و پرولین با اسپکتوفتومتری سراغ دارید؟
با سلام تا به حال بنده برای اندازه گیری امینواسید آرژنین و گوانین و پرولین از اسپکتوفتومتری استفاده نکرده ام . و برای سنجش آمینو اسیدها از HPLC استفاده کرده ام. اما یک راهنمایی برای شما. برای این کار باید ساختمان فضایی این چند اسید آمینه را مورد بررسی قرار دهیدو ببینید که از چه عامل های شیمیایی تشکیل شده است و این عامل های شیمیایی باید به صورت ویژه در این اسیدآمینه باشد. در صورت وجود چنین عاملی ، باید جذب UV آنها را پیدا کرده و توسط اسپکت آن را بخوانید . مثلا یک فنول یا غیره. باید دقت کنید که این عامل فقط در اسید آمینه مورد نظر باشد و در بقیه نباشد تا بتوانید نسبتی بین غلظت و جذبش پیدا کنید.و با بقیه اسیدآمینه ها تداخل نداشته باشد.
مثلا پرولین و آرژنین کربنی دارد که از یک طرف به گروه کربوکسیل و از طرف دیگر بهCH2 و از سوی دیگر بهNH2 و پیوندی هم با H دارد. حال اگر این چنین کربنی که نوع چهارم است در اسیدهای آمینه دیگر نباشد و طول موج UV این کربن را بتوانید پیدا کنید، می توانید از آن برای سنجش غلظت استفاده کنید.
سلام
می خواستم بدونم برای استفاده بار اول از کیسه دیالیز ساخت شرکت سیگما کار خاصی باید انجام داد تا کیسه فعال شود یا خیر؟با تشکر
بله
برای آماده سازی باید با EDTA , سدیم کربنات جوشانده شود. این کار را در قسمت آماده کردن کیسه دیالیز توضیح داده ام.
با تشکر
ممنون از توضیحتون
یعنی لازم نیست من وارد سایت شرکت سیگما بشم و شماره سریال کیسه دیالیزی رو که از اونا تحویل گرفتم رو وارد کنم و بعد ببینو برای فعات سازی کار خاصی باید کرد یا نه؟منظورم این است که فرقی نمیکند ساخت چه شرکتی است همه رو باEDTAفعال می کنند؟با تشکر
این کاری که توضیح دادم ، برای اکثر کیسه دیالیزها جواب می دهد. و بنده به نوع دیگری برخورد نکرده ام .
این که می گویم اکثر ، به این دلیل است که ممکن است شرکتی خاص از نوع خاصی مواد برای آهار دار کردن کیسه دیالیز استفاده کرده باشد ، که در این صورت حتما ، برای آماده سازی کیسه دیالیز به مشتریان توضیح ارائه خواهد کرد . اما اگر توضیحی نداده بود ، همین روش کفایت می کند .
با سلام و تشکر از مطالب مفید و روحیه علمی شما
اگه ممکنه از شما راهنمایی می خواستم، من روی سلول های فیبروبلاست انسانی کار می کنم، می خواستم برای بررسی بیان پروتئین خاصی از روش وسترن بلات استفاده کنم اما در مرحله استخراج پروتئین گیر کردم... پروتکل های زباد و جورواجوری پیدا کردم نمی دونم کدوم جواب می ده؟ گفتم از تجربه شما استفاده کنم .. با تشکر
سلام به شما
mitra pezeshk
اگر در انتخاب متد ، مشکل وجود دارد ، شما می توانید همه متدهای خود را بررسی نمایید و مشترکات را از آن استخراج کرده به آن عمل نمایید.
در ضمن سعی کنید خصوصیات پروتئین مورد نظر خود را ؛ از قبیل جرم مولکولی ، PI، پایداری در PH های مختلف و بافرهای مختلف بررسی کنید .
و حتما در مراحل مختلف از دیالیز استفاده کنید ، تا یون های مزاحم ، برای شما مشکل ایجاد نکند .
در همین قسمت نظرات کمی در مورد استخراج توضیح داده ام ، بد نیست به آن مراجعه شود .
به هر حال کارهای تحقیقی مسائل مربوط به خود را دارد و استثنائات نیز همیشه مشکل ساز است . اما هرچه پروتین خود را بیشتر بشناسید ، موفق تر خواهید بود .
شما کار را شروع کنید ، اگر با مشکلی مواجه شدید ، تا جایی که امکان داشته باشد ، کمکتان خواهم کرد.
با تشکر.
ارسال یک نظر